14.6: O surgimento da resistência às drogas

Objetivos de

• Descreva como o teste de difusão em disco Kirby-Bauer determina a suscetibilidade de um micróbio a um medicamento antibacteriano.
• Explique a importância da concentração inibitória mínima e da concentração bactericida mínima em relação à eficácia de um medicamento antimicrobiano.

Testar a eficácia de medicamentos antimicrobianos contra organismos específicos é importante para identificar seu espectro de atividade e a dosagem terapêutica. Esse tipo de teste, geralmente descrito como teste de suscetibilidade antimicrobiana (AST), é comumente realizado em um laboratório clínico. Nesta seção, discutiremos métodos comuns para testar a eficácia dos antimicrobianos.

O teste de difusão de disco Kirby-Bauer

O teste de difusão em disco Kirby-Bauer tem sido usado há muito tempo como ponto de partida para determinar a suscetibilidade de micróbios específicos a vários medicamentos antimicrobianos. O ensaio Kirby-Bauer começa com uma placa de ágar Mueller-Hinton na qual um gramado confluente é inoculado com o patógeno bacteriano isolado do paciente. Os discos de papel de filtro impregnados com quantidades conhecidas de medicamentos antibacterianos a serem testados são então colocados na placa de ágar. À medida que o inóculo bacteriano cresce, o antibiótico se difunde do disco circular para o ágar e interage com a bactéria em crescimento. A atividade antibacteriana é observada como uma zona circular clara de inibição ao redor do disco impregnado de fármaco, semelhante ao ensaio de difusão em disco. O diâmetro da zona de inibição, medido em milímetros e comparado a um gráfico padronizado, determina a suscetibilidade ou resistência do patógeno bacteriano ao medicamento.

Existem vários fatores que determinam o tamanho de uma zona de inibição neste ensaio, incluindo a solubilidade do fármaco, a taxa de difusão do fármaco através do ágar, a espessura do meio de ágar e a concentração do fármaco impregnado no disco. Devido à falta de padronização desses fatores, a interpretação do ensaio de difusão em disco Kirby-Bauer fornece apenas informações limitadas sobre suscetibilidade e resistência aos medicamentos testados. O ensaio não consegue distinguir entre atividades bacteriostáticas e bactericidas, e as diferenças nos tamanhos das zonas não podem ser usadas para comparar as potências ou eficácias dos medicamentos. A comparação dos tamanhos das zonas com um gráfico padronizado fornecerá apenas informações sobre os antibacterianos aos quais um patógeno bacteriano é suscetível ou resistente.

Exercício\(\PageIndex{1}\)

Como usar as informações de um ensaio de Kirby-Bauer para prever a eficácia terapêutica de um medicamento antimicrobiano em um paciente?

Antibiogramas: eliminando algumas das suposições das prescrições

Infelizmente, as doenças infecciosas não demoram muito para trabalhar em laboratório. Como resultado, os médicos raramente se dão ao luxo de realizar testes de suscetibilidade antes de prescreverem uma receita. Em vez disso, eles confiam principalmente na evidência empírica (ou seja, nos sinais e sintomas da doença) e em sua experiência profissional para fazer uma suposição fundamentada sobre o diagnóstico, o (s) agente (s) causador (s) e o medicamento com maior probabilidade de serem eficazes. Essa abordagem permite que o tratamento comece mais cedo, para que o paciente não precise esperar pelos resultados dos exames laboratoriais. Em muitos casos, a prescrição é eficaz; no entanto, em uma era de maior resistência antimicrobiana, está se tornando cada vez mais difícil selecionar a terapia empírica mais adequada. Selecionar uma terapia empírica inadequada não só coloca o paciente em risco, mas pode promover maior resistência ao medicamento prescrito.

Recentemente, estudos mostraram que os antibiogramas são ferramentas úteis no processo de tomada de decisão de selecionar a terapia empírica apropriada. Um antibiograma é uma compilação de dados locais de suscetibilidade a antibióticos, divididos por patógeno bacteriano. Em um estudo de novembro de 2014 publicado na revista Infection Control and Hospital Epidemiology, os pesquisadores determinaram que 85% das prescrições encomendadas em instalações de enfermagem qualificadas foram decididas empiricamente, mas apenas 35% dessas prescrições foram consideradas apropriadas quando comparadas com o eventual identificação de patógenos e perfil de suscetibilidade obtidos do laboratório clínico. No entanto, em uma unidade de enfermagem onde o uso de antibiogramas foi implementado para seleção direta da terapia empírica, a adequação da terapia empírica aumentou de 32% antes da implementação do antibiograma para 45% após a implementação dos antibiogramas. ¹ Embora esses dados sejam preliminares, eles sugerem que os estabelecimentos de saúde podem reduzir o número de prescrições inadequadas usando antibiogramas para selecionar a terapia empírica, beneficiando assim os pacientes e minimizando as oportunidades de desenvolvimento de resistência antimicrobiana.

Testes de diluição

Conforme discutido, as limitações do teste de difusão em disco Kirby-Bauer não permitem uma comparação direta das potências antibacterianas para orientar a seleção da melhor escolha terapêutica. No entanto, os testes de diluição antibacteriana podem ser usados para determinar a concentração inibitória mínima (MIC) de um medicamento específico, a menor concentração de medicamento que inibe o crescimento bacteriano visível e a concentração bactericida mínima (MBC), a menor concentração do medicamento que mata ≥ 99,9% do inóculo inicial . A determinação dessas concentrações ajuda a identificar o medicamento correto para um patógeno específico. Para o ensaio de diluição em macrocaldo, uma série de diluição do medicamento em caldo é feita em tubos de ensaio e o mesmo número de células de uma cepa bacteriana de teste é adicionado a cada tubo (Figura\(\PageIndex{1}\)). O MIC é determinado examinando os tubos para encontrar a menor concentração de fármaco que inibe o crescimento visível; isso é observado como turbidez (nebulosidade) no caldo. Tubos sem crescimento visível são então inoculados em meio de ágar sem antibiótico para determinar o MBC. Geralmente, os níveis séricos de um antibacteriano devem estar pelo menos três a cinco vezes acima do MIC para o tratamento de uma infecção.

Figura\(\PageIndex{1}\): Em um teste de diluição, a menor diluição que inibe a turbidez (nebulosidade) é o MIC. Neste exemplo, o MIC é de 8 μg/mL. O caldo de amostras sem turbidez pode ser inoculado em placas sem o medicamento antimicrobiano. A menor diluição que mata ≥ 99,9% do inóculo inicial observada nas placas é o MBC. (crédito: modificação da obra de Suzanne Wakim)

O ensaio MIC também pode ser realizado usando bandejas de microdiluição de 96 poços, que permitem o uso de pequenos volumes e dispositivos de dosagem automatizados, bem como o teste de vários antimicrobianos e/ou microrganismos em uma bandeja (Figura\(\PageIndex{2}\)). Os MICs são interpretados como a menor concentração que inibe o crescimento visível, o mesmo que para a diluição do macrocaldo em tubos de ensaio. O crescimento também pode ser interpretado visualmente ou usando um espectrofotômetro ou dispositivo similar para detectar turbidez ou mudança de cor se um substrato bioquímico apropriado que muda de cor na presença de crescimento bacteriano também estiver incluído em cada poço.

Figura\(\PageIndex{2}\): Uma bandeja de microdiluição também pode ser usada para determinar MICs de vários medicamentos antimicrobianos em um único ensaio. Neste exemplo, as concentrações do fármaco aumentam da esquerda para a direita e as fileiras com clindamicina, penicilina e eritromicina foram indicadas à esquerda da placa. Para penicilina e eritromicina, as menores concentrações que inibiram o crescimento visível são indicadas por círculos vermelhos e foram de 0,06 μg/mL para penicilina e 8 μg/mL para eritromicina. Para a clindamicina, o crescimento bacteriano visível foi observado em todas as concentrações de até 32 μg/mL e a CIM é interpretada como >32 μg/mL. (crédito: modificação do trabalho dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças)

O teste E é um método alternativo usado para determinar o MIC e é uma combinação do teste de difusão em disco Kirby-Bauer e dos métodos de diluição. Semelhante ao ensaio Kirby-Bauer, um gramado confluente de um isolado bacteriano é inoculado na superfície de uma placa de ágar. Em vez de usar discos circulares impregnados com uma concentração de fármaco, no entanto, tiras de plástico disponíveis comercialmente que contêm um gradiente de um antibacteriano são colocadas na superfície da placa de ágar inoculada (Figura\(\PageIndex{3}\)). À medida que o inóculo bacteriano cresce, o antibiótico se difunde das tiras de plástico para o ágar e interage com as células bacterianas. Como a taxa de difusão do fármaco está diretamente relacionada à concentração, uma zona elíptica de inibição é observada com o gradiente do fármaco Etest, em vez de uma zona circular de inibição observada com o ensaio Kirby-Bauer. Para interpretar os resultados, a interseção da zona elíptica com o gradiente na faixa que contém o medicamento indica o MIC. Como várias tiras contendo diferentes antimicrobianos podem ser colocadas na mesma placa, o MIC de vários antimicrobianos pode ser determinado simultaneamente e comparado diretamente. No entanto, diferentemente dos métodos de diluição com macrocaldo e microcaldo, o MBC não pode ser determinado com o Etest.

Figura\(\PageIndex{3}\): O Etest pode ser usado para determinar o MIC de um antibiótico. Neste Etest, a vancomicina demonstrou ter um MIC de 1,5 μg/mL contra Staphylococcus aureus.

Exercício\(\PageIndex{2}\)

Compare e contraste MIC e MBC.

Foco clínico: Resolução

A ITU de Marisa provavelmente foi causada pelos cateterismos que ela fez no Vietnã. A maioria das bactérias que causam ITUs são membros da microbiota intestinal normal, mas podem causar infecções quando introduzidas no trato urinário, como pode ter ocorrido quando o cateter foi inserido. Como alternativa, se o cateter em si não fosse estéril, bactérias em sua superfície poderiam ter sido introduzidas no corpo de Marisa. A terapia antimicrobiana que Marisa recebeu no Camboja também pode ter sido um fator complicador, pois ela pode ter selecionado cepas resistentes a antimicrobianos já presentes em seu corpo. Essas bactérias já teriam contido genes de resistência antimicrobiana, adquiridos por mutação espontânea ou por transferência horizontal de genes, e, portanto, tinham a melhor vantagem evolutiva para adaptação e crescimento na presença da terapia antimicrobiana. Como resultado, uma dessas cepas resistentes pode ter sido posteriormente introduzida em seu trato urinário.

Testes laboratoriais no CDC confirmaram que a cepa de Klebsiella pneumoniae da amostra de urina de Marisa foi positiva para a presença de NDM, uma carbapenemase muito ativa que está começando a surgir como um novo problema na resistência antimicrobiana. Embora as cepas NDM-positivas sejam resistentes a uma ampla gama de antimicrobianos, elas mostraram suscetibilidade à tigeciclina (estruturalmente relacionada à tetraciclina) e às polimixinas B e E (colistina).

Para evitar que a infecção se espalhasse, Marisa foi isolada dos outros pacientes em uma sala separada. Todos os funcionários do hospital que interagiram com ela foram aconselhados a seguir protocolos rígidos para evitar a contaminação da superfície e do equipamento. Isso incluiria práticas especialmente rigorosas de higiene das mãos e desinfecção cuidadosa de todos os itens que entrassem em contato com ela.

A infecção de Marisa finalmente respondeu à tigeciclina e acabou desaparecendo. Ela recebeu alta algumas semanas após a admissão, e uma amostra de fezes de acompanhamento mostrou que suas fezes estavam livres de K. pneumoniae contendo NDM, o que significa que ela não estava mais abrigando a bactéria altamente resistente.

Conceitos principais e resumo

• O teste de difusão em disco Kirby-Bauer ajuda a determinar a suscetibilidade de um microrganismo a vários medicamentos antimicrobianos. No entanto, as zonas de inibição medidas devem ser correlacionadas a padrões conhecidos para determinar a suscetibilidade e a resistência, e não fornecer informações sobre a atividade bactericida versus bacteriostática, nem permitir a comparação direta das potências dos medicamentos.
• Os antibiogramas são úteis para monitorar as tendências locais de resistência/suscetibilidade antimicrobiana e para direcionar a seleção apropriada da terapia antibacteriana empírica.
• Existem vários métodos laboratoriais disponíveis para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de um medicamento antimicrobiano contra um micróbio específico. A concentração bactericida mínima (MBC) também pode ser determinada, normalmente como um experimento de acompanhamento da determinação do MIC usando o método de diluição em tubo.

Notas de pé

1. 1 J.P. Furuno et al. “Usando antibiogramas para melhorar a prescrição de antibióticos em instalações de enfermagem qualificadas.” Controle de infecção e epidemiologia hospitalar 35 no. Fornecimento S3 (2014) :S56—61.