14.6: 耐药性的出现

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学习目标

描述 Kirby-Bauer 磁盘扩散测试如何确定微生物对抗菌药物的敏感性。
解释最低抑菌浓度和最低杀菌浓度相对于抗微生物药物有效性的重要性。

测试抗微生物药物对特定生物的有效性对于确定其活性范围和治疗剂量非常重要。这种类型的测试通常被称为抗微生物药物敏感性测试（AST），通常在临床实验室进行。在本节中，我们将讨论测试抗微生物药物有效性的常用方法。

Kirby-Bauer 磁盘扩散测试

长期以来，Kirby-Bauer 磁盘扩散测试一直被用作确定特定微生物对各种抗微生物药物敏感性的起点。 Kirby-Bauer 测定从穆勒-欣顿琼脂板开始，在汇合草坪上接种患者分离的细菌病原体。然后将浸有待测试的已知数量抗菌药物的滤纸盘放在琼脂板上。随着细菌接种物的生长，抗生素会从圆盘扩散到琼脂中，并与生长中的细菌相互作用。据观察，抗菌活性是药物浸渍盘周围的透明圆形抑制区，类似于盘状扩散试验。抑制区的直径（以毫米为单位）与标准化图表进行比较，决定了细菌病原体对药物的敏感性或耐药性。

有多种因素决定了该测定中抑制区的大小，包括药物溶解度、药物通过琼脂的扩散速率、琼脂培养基的厚度以及浸入盘中的药物浓度。由于这些因素缺乏标准化，对Kirby-Bauer磁盘扩散测定的解释仅提供了有关所测试药物的易感性和耐药性的有限信息。该测定无法区分抑菌活性和杀菌活性，区域大小的差异不能用来比较药物的效力或疗效。将区域大小与标准化图表进行比较只能提供有关细菌病原体易感或耐药的抗菌药物的信息。

练习\(\PageIndex{1}\)

如何利用柯比鲍尔测定中的信息来预测抗微生物药物对患者的治疗效果？

抗生素图：消除处方中的一些猜测

不幸的是，传染病不需要超时才能完成实验室工作。因此，医生在开处方之前很少有奢侈地进行易感性测试。相反，他们主要依靠经验证据（即疾病的体征和症状）和专业经验，对最有可能有效的诊断、病原体和药物做出有根据的猜测。这种方法可以更快地开始治疗，因此患者不必等待实验室测试结果。在许多情况下，处方是有效的；但是，在抗微生物药物耐药性增加的时代，选择最合适的经验疗法变得越来越困难。选择不恰当的经验疗法不仅会使患者处于危险之中，而且可能增加对处方药物的耐药性。

最近，研究表明，抗生素图是选择适当经验疗法的决策过程中的有用工具。抗生素图是按细菌病原体细分的当地抗生素敏感性数据的汇编。在2014年11月发表在《感染控制与医院流行病学》杂志上的一项研究中，研究人员确定，在熟练护理机构订购的处方中有85％是根据经验决定的，但与之相比，这些处方中只有35％被认为是合适的从临床实验室获得的最终病原体鉴定和易感概况。但是，在一家使用抗生素图来指导经验疗法的选择的护理机构中，经验疗法的适当性从抗生素图实施前的32％提高到实施抗生素项目后的45％。 ¹ 尽管这些数据是初步数据，但它们确实表明，医疗机构可以通过使用抗生素来选择经验疗法来减少不当处方的数量，从而使患者受益并最大限度地减少出现抗微生物药物耐药性的机会。

稀释测试

如前所述，Kirby-Bauer Disk 扩散测试的局限性不允许直接比较抗菌效力来指导选择最佳治疗选择。但是，抗菌稀释测试可用于确定特定药物的最低抑制浓度 (MIC)、抑制可见细菌生长的药物的最低浓度和最低杀菌浓度 (MBC)，即杀死 ≥ 99.9% 起始接种物的最低药物浓度。确定这些浓度有助于确定特定病原体的正确药物。对于大肉汤稀释试验，在试管中对肉汤中的药物进行一系列稀释，并在每根试管中添加相同数量的测试细菌菌株细胞（图\(\PageIndex{1}\)）。 MIC 是通过检查试管来确定抑制可见生长的最低药物浓度来确定的；这被观察为肉汤中的浊度（浑浊）。然后将没有明显生长的试管接种到不含抗生素的琼脂培养基上以测定 MBC。通常，在治疗感染时，血清抗菌水平应至少高于 MIC 的三到五倍。

一系列的管子。含有 2 微克/毫升的试管会生长，含有 4 微克/毫升的管子也会生长。带有 8、16 和 32 的管子没有生长 — 图\(\PageIndex{1}\)：在稀释测试中，抑制浊度（混浊）的最低稀释度是 MIC。在本示例中，MIC 为 8 微克/毫升。没有混浊的样品中的肉汤可以接种到缺少抗微生物药物的板上。在板上观察到的杀死 ≥ 99.9% 的起始接种物的最低稀释度是 MBC。（来源：苏珊娜·瓦基姆对作品的修改）

MIC 测定也可以使用 96 孔微稀释托盘进行，这允许使用小体积的自动分配设备，也可以在一个托盘中测试多种抗微生物药物和/或微生物（图\(\PageIndex{2}\)）。 MICs被解释为抑制可见生长的最低浓度，与试管中大汤稀释的浓度相同。如果每口井中还含有在细菌生长时会改变颜色的合适的生化底物，也可以直观地解释生长情况，或者使用分光光度计或类似设备来检测浊度或颜色变化。

一个 64 孔板；8 行和 12 列。战斗的注意力从左开始增加。每行都有不同的抗生素。 MIC 由没有生长的最低浓度决定，从井里看清而不是暗淡的样子可以看出。对于克林霉素，MIC 超过了每 mL 32 微克的最高浓度。青霉素的MIC为0.06，红霉素的MIC为每毫升8微克。底行显示正面和负面对照。 — 图\(\PageIndex{2}\)：微稀释盘还可用于在一次测定中确定多种抗微生物药物的 MIC。在本例中，药物浓度从左向右增加，板块左侧显示了含有克林霉素、青霉素和红霉素的行。对于青霉素和红霉素，抑制可见生长的最低浓度以红圈表示，青霉素为0.06 μg/mL，红霉素为8 μg/mL。对于克林霉素，观察到每种浓度高达32 μg/mL时细菌都有明显的生长，MIC被解释为>32 μg/mL。（来源：疾病控制与预防中心对工作的修改）

Etest 是用于测定 MIC 的替代方法，它是 Kirby-Bauer 磁盘扩散测试和稀释方法的组合。与 Kirby-Bauer 测定类似，将细菌分离物的汇合草坪接种到琼脂板的表面。但是，与其使用浸有一种浓度药物的圆盘，不如将市售的含有抗菌梯度的塑料条放在接种过的琼脂板的表面上（图\(\PageIndex{3}\)）。随着细菌接种物的生长，抗生素会从塑料条中扩散到琼脂中，并与细菌细胞相互作用。由于药物扩散速率与浓度直接相关，因此使用Etest药物梯度观察到椭圆的抑制区域，而不是使用Kirby-Bauer测定观察到的圆形抑制区域。为了解释结果，椭圆区域与含药物条带上梯度的交点表示 MIC。由于可以将含有不同抗微生物药物的多条试纸放在同一个板上，因此可以同时确定多种抗微生物药物的 MIC 并直接比较。但是，与大汤和微汤稀释方法不同，MBC 无法使用 Etest 来确定。

一条在细菌草坪上写着数字的条带。条带顶部的浓度最高；底部的浓度最低。细菌能够以每毫升低于 1.5 微克的速度生长 — 图\(\PageIndex{3}\)：Etest 可用于确定抗生素的 MIC。在这次测试中，万古霉素对抗*金黄色葡萄球菌*的MIC为1.5 μg/mL。

练习\(\PageIndex{2}\)

比较和对比 MBC 和 MBC。

临床重点：分辨率

玛丽莎的尿路感染很可能是她在越南接受的导管插入术引起的。大多数引起 UTI 的细菌都是正常肠道微生物群的成员，但它们在引入尿路时会引起感染，就像插入导管时可能发生的那样。或者，如果导管本身不是无菌的，则其表面的细菌可能会被引入玛丽莎的体内。玛丽莎在柬埔寨接受的抗微生物疗法也可能是一个复杂的因素，因为它可能选择了她体内已经存在的抗微生物药物耐药菌株。这些细菌本来已经含有抗微生物药物耐药性基因，要么是通过自发突变获得的，要么是通过水平基因转移获得的，因此，在抗微生物疗法存在的情况下，它们在适应和生长方面具有最大的进化优势。结果，其中一种耐药菌株可能随后被引入她的尿道。

疾病预防控制中心的实验室测试证实，来自玛丽莎尿液样本的肺炎克雷伯氏菌菌株对NDM的存在呈阳性，NDM是一种非常活跃的碳青霉烯酶，已开始成为抗微生物药物耐药性的新问题。虽然 NDM 阳性菌株对多种抗微生物药物具有耐药性，但它们已显示出对替加环素（结构上与四环素相关）和多粘菌素 B 和 E（粘菌素）的敏感性。

为了防止感染扩散，玛丽莎与其他患者隔离开了一个单独的房间。建议所有与她互动的医院工作人员遵守严格的规程，以防止表面和设备污染。这将包括特别严格的手部卫生习惯以及对所有与她接触的物品进行仔细消毒。

玛丽莎的感染终于对替加环素产生了反应，最终消失了。她在入院几周后出院，后续粪便样本显示她的粪便中没有含有 NDM 的肺炎杆菌，这意味着她不再携带这种高耐药性细菌。

关键概念和摘要

Kirby-Bauer 磁盘扩散测试有助于确定微生物对各种抗微生物药物的敏感性。但是，测量的抑制区域必须与已知标准相关以确定易感性和耐药性，并且不提供有关杀菌和抑菌活性的信息，也不能直接比较药物效力。
抗生素图可用于监测当地抗微生物药物耐药性/易感性的趋势，并指导经验性抗菌疗法的适当选择。
有几种实验室方法可用于确定抗微生物药物对特定微生物的最低抑制浓度（MIC）。也可以确定最低杀菌浓度 (MBC)，通常是使用试管稀释法测定 MIC 的后续实验。

脚注

1 J.P. Furuno 等人 “使用抗生素图改善熟练护理机构的抗生素处方。” 感染控制和医院流行病学 35 no. Suppl S3 (2014): S56—61。