7.5: Kutumia Biokemia kutambua microorganisms

Malengo ya kujifunza

• Eleza mifano ya bidhaa za biosynthesis ndani ya seli ambazo zinaweza kugunduliwa kutambua bakteria

Utambulisho sahihi wa hutenganisha bakteria ni muhimu katika maabara ya kliniki ya microbiolojia kwa sababu matokeo mara nyingi huwajulisha maamuzi kuhusu matibabu ambayo yanaathiri moja kwa moja matokeo ya mgonjwa. Kwa mfano, kesi za sumu ya chakula zinahitaji utambulisho sahihi wa wakala wa causative ili madaktari waweze kuagiza matibabu sahihi. Vivyo hivyo, ni muhimu kutambua kwa usahihi pathogen causative wakati wa kuzuka kwa ugonjwa ili mikakati sahihi inaweza kuajiriwa ili kuwa na janga hilo.

Kuna njia nyingi za kuchunguza, tabia, na kutambua microorganisms. Mbinu zingine zinategemea sifa za biochemical za phenotypic, wakati wengine hutumia kitambulisho cha genotypic. Tabia za biochemical za bakteria hutoa sifa nyingi ambazo ni muhimu kwa uainishaji na utambulisho. Kuchambua uwezo wa lishe na metabolic ya kujitenga kwa bakteria ni njia ya kawaida ya kuamua jenasi na aina ya bakteria. Baadhi ya njia muhimu metabolic kwamba bakteria kutumia kuishi itajadiliwa katika Microbial Metabolism. Katika sehemu hii, tutajadili mbinu chache zinazotumia sifa za biochemical kutambua microorganisms.

Baadhi ya microorganisms kuhifadhi misombo fulani kama granules ndani ya cytoplasm yao, na yaliyomo ya granules hizi inaweza kutumika kwa madhumuni ya kitambulisho. Kwa mfano, poly-β-hydroxybutyrate (PHB) ni kiwanja cha kuhifadhi kaboni na nishati kinachopatikana katika baadhi ya bakteria zisizo za umeme za jenasi Pseudomonas. Spishi tofauti ndani ya jenasi hii zinaweza kuainishwa kwa kuwepo au kutokuwepo kwa PHB na rangi za fluorescent. Kisababishi cha binadamu P. aeruginosa na kisababishi cha mimea P. sirinkae ni mifano miwili ya spishi za Pseudomonas za fluorescent ambazo hazikusanyiko CHEMBE za PHB.

Mifumo mingine hutegemea sifa za biochemical kutambua vijiumbe kwa athari zao za biochemical, kama vile matumizi ya kaboni na vipimo vingine vya kimetaboliki. Katika mazingira madogo ya maabara au katika maabara ya kufundisha, majaribio hayo yanafanywa kwa kutumia idadi ndogo ya zilizopo za mtihani. Hata hivyo, mifumo ya kisasa zaidi, kama ile iliyoandaliwa na Biolog, Inc, inategemea paneli za athari za biochemical zilizofanywa wakati huo huo na kuchambuliwa na programu. Mfumo wa Biologi hutambua seli kulingana na uwezo wao wa metabolize biochemicals fulani na juu ya mali zao za kisaikolojia, ikiwa ni pamoja na pH na unyeti wa kemikali. Inatumia madarasa yote makubwa ya biochemicals katika uchambuzi wake. Utambulisho unaweza kufanywa manually au kwa nusu- au vyombo kikamilifu automatiska.

Mfumo mwingine automatiska hutambua microorganisms kwa kuamua specimen ya wingi wigo na kisha kulinganisha na database ambayo ina inayojulikana wingi spectra kwa maelfu ya microorganisms. Njia hii ni msingi wa matrix-kusaidiwa laser desorption/ionization wakati-ya-ndege molekuli spectrometry (MALDI-TOF) na hutumia sahani za MALDI zilizopo ambazo microorganism huchanganywa na reagent maalumu ya tumbo (Kielelezo\(\PageIndex{1}\)). Mchanganyiko wa sampuli/reagent huwashwa na laser ya ultraviolet yenye kiwango kikubwa, na kusababisha ejection ya ions za gesi zinazozalishwa kutoka kwa vipengele mbalimbali vya kemikali vya microorganism. Ions hizi za gesi zinakusanywa na kuharakishwa kwa njia ya spectrometer ya molekuli, na ions kusafiri kwa kasi inayoamua na uwiano wao wa molekuli hadi malipo (m/z), hivyo, kufikia detector kwa nyakati tofauti. Mpango wa ishara ya detector dhidi ya m/z hutoa wigo wa wingi kwa viumbe ambavyo ni ya kipekee kuhusiana na muundo wake wa biochemical. Kulinganisha wingi wigo kwa maktaba ya kumbukumbu spectra kupatikana kutoka uchambuzi kufanana ya microorganisms inayojulikana vibali utambulisho wa microbe haijulikani.

Kielelezo\(\PageIndex{1}\): Mbinu za MALDI-TOF sasa hutumiwa mara kwa mara kwa taratibu za uchunguzi katika maabara ya kliniki ya microbiolojia. Teknolojia hii ina uwezo wa kutambua kwa haraka baadhi ya vijiumbe ambavyo haviwezi kutambuliwa kwa urahisi na mbinu za jadi zaidi. (mikopo “picha ya sahani ya MALDI”: mabadiliko ya kazi na Chen Q, Liu T, Chen G; mikopo “grafu”: mabadiliko ya kazi na Bailes J, Vidal L, Ivanov DA, Soloviev M)

Microbes pia inaweza kutambuliwa kwa kupima maelezo yao ya kipekee ya lipid. Kama tulivyojifunza, asidi ya mafuta ya lipids yanaweza kutofautiana kwa urefu wa mlolongo, uwepo au kutokuwepo kwa vifungo mara mbili, na idadi ya vifungo viwili, makundi ya hydroxyl, matawi, na pete. Ili kutambua microbe kwa utungaji wake wa lipid, asidi ya mafuta iliyopo kwenye membrane yao huchambuliwa. Uchunguzi wa kawaida wa biochemical unaotumiwa kwa kusudi hili ni mbinu inayotumiwa katika kliniki, afya ya umma, na maabara ya chakula. Inategemea kuchunguza tofauti za kipekee katika asidi za mafuta na huitwa fatty acid methyl ester (FAME) uchambuzi. Katika uchambuzi wa FAME, asidi ya mafuta hutolewa kwenye utando wa microorganisms, kemikali hubadilishwa ili kuunda esta za methyl tete, na kuchambuliwa na chromatography ya gesi (GC). kusababisha GC chromatogram ikilinganishwa na chromatograms kumbukumbu katika database zenye data kwa maelfu ya kutengwa bakteria kutambua microorganism haijulikani (Kielelezo\(\PageIndex{2}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{2}\): Fatty acid methyl ester (FAME) uchambuzi katika matokeo ya utambulisho bakteria katika chromatogram kipekee kwa kila bakteria. Kila kilele katika chromatogram ya gesi kinalingana na esta fulani ya methyl asidi ya mafuta na urefu wake ni sawia na kiasi kilichopo kwenye seli. (mikopo “utamaduni”: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa; mikopo “grafu”: mabadiliko ya kazi na Zhang P. na Liu P.)

Njia inayohusiana na utambulisho wa microorganism inaitwa phospholipid inayotokana na fatty kali (PLFA) uchambuzi. Vipande vinajumuisha phospholipids, ambayo inaweza kuwa saponified (hidrolisisi na alkali) ili kutolewa asidi ya mafuta. Mchanganyiko wa asidi ya mafuta husababishwa na uchambuzi wa FAME, na maelezo ya lipid yaliyopimwa yanaweza kulinganishwa na yale ya microorganisms inayojulikana kutambua microorganism haijulikani.

Utambulisho wa bakteria pia unaweza kutegemea protini zinazozalishwa chini ya hali maalum ya ukuaji ndani ya mwili wa binadamu. Aina hizi za taratibu za kitambulisho huitwa uchambuzi wa proteomiki. Ili kufanya uchambuzi wa proteomiki, protini kutoka kwa pathojeni hutenganishwa kwanza na chromatografia ya kioevu ya juu-shinikizo (HPLC), na sehemu zilizokusanywa zinatengenezwa kisha kuzalisha vipande vidogo vya peptidi. Peptidi hizi zinatambuliwa na spectrometry ya molekuli na ikilinganishwa na zile za vijidudu vinavyojulikana kutambua microorganism isiyojulikana katika specimen ya awali.

Microorganisms pia inaweza kutambuliwa na wanga zilizounganishwa na protini (glycoproteins) katika utando wa plasma au ukuta wa seli. Antibodies na protini nyingine za kumfunga wanga zinaweza kushikamana na wanga maalum kwenye nyuso za seli, na kusababisha seli ziwe pamoja. Vipimo vya kisiasa (k.m. vipimo vya makundi ya Lancefield, ambavyo hutumika kwa ajili ya utambulisho wa spishi za Streptococcus) hufanywa kuchunguza wanga wa pekee uliopo kwenye uso wa seli.

Mtazamo wa Hospitali

Penny aliacha kutumia jua lake jipya na alitumia cream ya corticosteroid kwa upele wake kama ilivyoagizwa. Hata hivyo, baada ya siku kadhaa, upele wake haukuboreshwa na kwa kweli ulionekana kuwa mbaya zaidi. Alifanya uteuzi wa kufuatilia na daktari wake, ambaye aliona upele wa rangi nyekundu na malengelenge yaliyojaa pus karibu na follicles ya nywele (Kielelezo\(\PageIndex{3}\)). Upele huo ulikuwa umejilimbikizia hasa katika maeneo ambayo yangefunikwa na swimsuit. Baada ya kuhoji, Penny alimwambia daktari kwamba hivi karibuni alihudhuria chama cha pool na alitumia muda katika tub moto. Kutokana na taarifa hii mpya, daktari watuhumiwa kesi ya moto tub upele, maambukizi mara nyingi unasababishwa na bakteria Pseudomonas aeruginosa, yanayoambatana pathogen ambayo inaweza kustawi katika tubs moto na mabwawa ya kuogelea, hasa wakati maji si kutosha klorini. P. aeruginosa ni bakteria sawa inayohusishwa na maambukizi katika mapafu ya wagonjwa wenye fibrosis ya cystic.

Kielelezo\(\PageIndex{3}\): Mfiduo wa Pseudomonas aeruginosa katika maji ya bwawa au tub moto wakati mwingine unaweza kusababisha maambukizi ya ngozi ambayo yanaonyesha kama “moto tub upele.” (mikopo: muundo wa kazi na “Lsupellmel” /Wikimedia Commons)

Daktari alikusanya specimen kutoka upele wa Penny ili kutumwa kwenye maabara ya kliniki ya microbiolojia. Vipimo vya uthibitisho vilifanyika ili kutofautisha P. aeruginosa kutoka kwa vimelea vya enteric ambavyo vinaweza pia kuwepo katika maji ya bwawa na ya moto. Jaribio lilijumuisha uzalishaji wa pyocyanini ya rangi ya bluu-kijani kwenye agar ya cetrimide na ukuaji wa 42 °C Cetrimide ni wakala wa kuchagua ambao huzuia ukuaji wa aina nyingine za flora microbial na pia huongeza uzalishaji wa P. aeruginosa rangi pyocyanin na fluorescein, ambayo ni tabia ya bluu-kijani na njano-kijani, kwa mtiririko huo.

Uchunguzi ulithibitisha kuwepo kwa P. aeruginosa katika sampuli ya ngozi ya Penny, lakini daktari aliamua kuagiza antibiotic. Japokuwa P. aeruginosa ni bakteria, spishi za Pseudomonas kwa ujumla zinakabiliwa na antibiotiki nyingi. Kwa bahati nzuri, maambukizi ya ngozi kama Penny ni kawaida binafsi kikwazo; upele kawaida huchukua muda wa wiki 2 na kutatua peke yake, pamoja na au bila matibabu. Daktari alimshauri Penny kusubiri nje na kuendelea kutumia cream ya corticosteroid. Cream haitaua P. aeruginosa kwenye ngozi ya Penny, lakini inapaswa kutuliza upele wake na kupunguza kupungua kwa kukandamiza majibu ya uchochezi ya mwili wake kwa bakteria.

Dhana muhimu na Muhtasari

• Utambulisho sahihi wa bakteria ni muhimu katika maabara ya kliniki kwa ajili ya uchunguzi na usimamizi wa magonjwa ya magonjwa, magonjwa, na sumu ya chakula inayosababishwa na kuzuka kwa bakteria.
• Utambulisho wa phenotypiki wa vijiumbe huhusisha kutumia sifa zinazoonekana, ikiwa ni pamoja na maelezo ya vipengele vya kimuundo kama vile lipidi, bidhaa za biosintetiki kama vile sukari au asidi amino, au misombo ya kuhifadhi kama vile poly-β-hydroxybutyrate.
• microbe haijulikani inaweza kutambuliwa kutoka kipekee wingi wigo zinazozalishwa wakati ni kuchambuliwa na Matrix kusaidiwa laser desorption/ionization wakati wa ndege molekuli spectrometry (MALDI-TOF).
• Viumbe vidogo vinaweza kutambuliwa kwa kuamua nyimbo zao za lipid, kwa kutumia esta ya methyl ya asidi ya mafuta (FAME) au uchambuzi wa asidi ya mafuta inayotokana na phospholipid (PLFA).
• Uchunguzi wa proteomic, utafiti wa protini zote zilizokusanywa za viumbe, pia inaweza kutumika kwa utambulisho wa bakteria.
• Glycoproteins katika utando wa plasma au miundo ya ukuta wa seli inaweza kumfunga kwa lectini au antibodies na inaweza kutumika kwa ajili ya utambulisho.