20.1: Aplicações práticas de anticorpos monoclonais e policlonais

Objetivos de

• Compare o método de desenvolvimento, uso e características de anticorpos monoclonais e policlonais
• Explique a natureza da reatividade cruzada de anticorpos e por que isso é menos problemático com anticorpos monoclonais

Foco clínico: Parte 1

Em um incidente infeliz, um profissional de saúde que lutava contra o vício foi pego roubando seringas de analgésicos e substituindo-as por seringas cheias de substâncias desconhecidas. O hospital imediatamente demitiu o funcionário e o prendeu; no entanto, dois pacientes com os quais ele havia trabalhado posteriormente testaram positivo para HIV.

Embora não houvesse provas de que as infecções se originaram das seringas contaminadas, o médico de saúde pública do hospital tomou medidas imediatas para determinar se algum outro paciente havia sido colocado em risco. Embora o trabalhador estivesse empregado por pouco tempo, foi determinado que ele havia entrado em contato com mais de 1300 pacientes. O hospital decidiu entrar em contato com todos esses pacientes e fazer o teste de HIV.

Exercício\(\PageIndex{1}\)

1. Por que o hospital acha necessário testar o HIV em todos os pacientes?
2. Que tipos de testes podem ser usados para determinar se um paciente tem HIV?

Além de serem cruciais para nossa resposta imune normal, os anticorpos fornecem ferramentas poderosas para fins de pesquisa e diagnóstico. A alta especificidade dos anticorpos os torna uma excelente ferramenta para detectar e quantificar uma ampla gama de alvos, de medicamentos a proteínas séricas e microrganismos. Com ensaios in vitro, os anticorpos podem ser usados para precipitar antígenos solúveis, aglutinar (aglomerar) células, opsonizar e matar bactérias com a ajuda do complemento e neutralizar drogas, toxinas e vírus.

A especificidade de um anticorpo resulta do sítio de ligação ao antígeno formado nas regiões variáveis - regiões do anticorpo que têm padrões únicos de aminoácidos que só podem se ligar aos antígenos-alvo com uma sequência molecular que fornece cargas complementares e ligações não covalentes. No entanto, existem limitações na especificidade dos anticorpos. Alguns antígenos são tão quimicamente semelhantes que ocorre reatividade cruzada; em outras palavras, anticorpos criados contra um antígeno se ligam a um antígeno quimicamente semelhante, mas diferente. Considere um antígeno que consiste em uma única proteína com vários epítopos (Figura\(\PageIndex{1}\)). Essa proteína única pode estimular a produção de muitos anticorpos diferentes, alguns dos quais podem se ligar a epítopos quimicamente idênticos em outras proteínas.

É mais provável que ocorra reatividade cruzada entre anticorpos e antígenos com baixa afinidade ou avidez. A afinidade, que pode ser determinada experimentalmente, é uma medida da força de ligação entre o sítio de ligação de um anticorpo e um epítopo, enquanto a avidez é a força total de todas as interações em um complexo anticorpo-antígeno (que pode ter mais de um local de ligação). A avidez é influenciada pela afinidade, bem como pelos arranjos estruturais do epítopo e pelas regiões variáveis do anticorpo. Se um anticorpo tem uma alta afinidade/avidez por um antígeno específico, é menos provável que ele reaja de forma cruzada com um antígeno para o qual tem menor afinidade/avidez.

Figura\(\PageIndex{1}\): Um anticorpo se liga a uma região específica em um antígeno chamado epítopo. Um único antígeno pode ter vários epítopos para diferentes anticorpos específicos.

Exercício\(\PageIndex{2}\)

1. Qual propriedade torna os anticorpos úteis para pesquisas e diagnósticos clínicos?
2. O que é reatividade cruzada e por que ela ocorre?

Produzindo anticorpos policlonais

Os anticorpos usados para fins de pesquisa e diagnóstico geralmente são obtidos pela injeção de um antígeno específico em um animal de laboratório, como um coelho ou uma cabra. Em algumas semanas, o sistema imunológico do animal produzirá altos níveis de anticorpos específicos para o antígeno. Esses anticorpos podem ser colhidos em um antissoro, que é o soro integral coletado de um animal após a exposição a um antígeno. Como a maioria dos antígenos são estruturas complexas com vários epítopos, eles resultam na produção de vários anticorpos no animal de laboratório. Essa chamada resposta de anticorpos policlonais também é típica da resposta à infecção pelo sistema imunológico humano. O antissoro retirado de um animal, portanto, conterá anticorpos de vários clones de células B, com cada célula B respondendo a um epítopo específico do antígeno (Figura\(\PageIndex{2}\)).

Os animais de laboratório geralmente são injetados pelo menos duas vezes com antígeno quando usados para produzir antissoro. A segunda injeção ativará as células de memória que produzem anticorpos IgG da classe IgG contra o antígeno. As células de memória também sofrem maturação por afinidade, resultando em um conjunto de anticorpos com maior afinidade média. A maturação por afinidade ocorre devido a mutações nas regiões variáveis do gene da imunoglobulina, resultando em células B com sítios de ligação ao antígeno ligeiramente alterados. Na reexposição ao antígeno, as células B capazes de produzir anticorpos com sítios de ligação ao antígeno de maior afinidade serão estimuladas a proliferar e produzir mais anticorpos do que seus pares de baixa afinidade. Um adjuvante, que é uma substância química que provoca uma ativação generalizada do sistema imunológico que estimula uma maior produção de anticorpos, geralmente é misturado ao antígeno antes da injeção.

O antissoro obtido de animais não só conterá anticorpos contra o antígeno introduzido artificialmente em laboratório, mas também conterá anticorpos contra quaisquer outros antígenos aos quais o animal tenha sido exposto durante sua vida. Por esse motivo, os antissoros devem primeiro ser “purificados” para remover outros anticorpos antes de usá-los em pesquisas ou ensaios de diagnóstico.

Figura\(\PageIndex{2}\): Este diagrama ilustra o processo de coleta de anticorpos policlonais produzidos em resposta a um antígeno.

Usos clínicos de antissoros policlonais

Os antissoros policlonais são usados em muitos testes clínicos projetados para determinar se um paciente está produzindo anticorpos em resposta a um patógeno específico. Embora esses testes sejam certamente ferramentas de diagnóstico poderosas, eles têm suas limitações, porque são um meio indireto de determinar se um determinado patógeno está presente. Testes baseados em uma resposta policlonal às vezes podem levar a um resultado falso positivo, ou seja, um teste que confirma a presença de um antígeno que, na verdade, não está presente. Os testes baseados em anticorpos também podem resultar em um resultado falso negativo, que ocorre quando o teste não consegue detectar um anticorpo que está, de fato, presente.

A precisão dos testes de anticorpos pode ser descrita em termos de sensibilidade e especificidade do teste. A sensibilidade do teste é a probabilidade de obter um resultado positivo quando o paciente está realmente infectado. Se um teste tiver alta sensibilidade, a probabilidade de um falso negativo é baixa. A especificidade do teste, por outro lado, é a probabilidade de obter um resultado negativo quando o paciente não está infectado. Se um teste tem alta especificidade, a probabilidade de um falso positivo é baixa.

Falsos positivos geralmente ocorrem devido à reatividade cruzada, que pode ocorrer quando epítopos de um patógeno diferente são semelhantes aos encontrados no patógeno que está sendo testado. Por esse motivo, os testes baseados em anticorpos são frequentemente usados apenas como testes de triagem; se os resultados forem positivos, outros testes confirmatórios são usados para garantir que os resultados não sejam falsos positivos.

Por exemplo, uma amostra de sangue de um paciente suspeito de ter hepatite C pode ser rastreada para o vírus usando anticorpos que se ligam aos antígenos do vírus da hepatite C. Se o paciente estiver realmente infectado com o vírus da hepatite C, os anticorpos se ligarão aos antígenos, produzindo um resultado positivo no teste. Se o paciente não estiver infectado com o vírus da hepatite C, os anticorpos geralmente não se ligam a nada e o teste deve ser negativo; no entanto, um falso positivo pode ocorrer se o paciente tiver sido previamente infectado por qualquer um dos vários patógenos que provocam anticorpos que reagem de forma cruzada com a hepatite C antígenos virais. Os testes de anticorpos para hepatite C têm alta sensibilidade (baixa probabilidade de falso negativo), mas baixa especificidade (alta probabilidade de falso positivo). Assim, pacientes com teste positivo devem fazer um segundo teste confirmatório para descartar a possibilidade de um falso positivo. O teste confirmatório é um teste mais caro e demorado que testa diretamente a presença de RNA viral da hepatite C no sangue. Somente após o teste confirmatório dar positivo, o paciente pode ser definitivamente diagnosticado com uma infecção por hepatite C. Testes baseados em anticorpos podem resultar em um falso negativo se, por qualquer motivo, o sistema imunológico do paciente não tiver produzido níveis detectáveis de anticorpos. Para algumas doenças, pode levar várias semanas após a infecção até que o sistema imunológico produza anticorpos suficientes para cruzar o limite de detecção do ensaio. Em pacientes imunocomprometidos, o sistema imunológico pode não ser capaz de produzir um nível detectável de anticorpos.

Outra limitação do uso da produção de anticorpos como indicador de doença é que os anticorpos no sangue persistirão por muito tempo após a eliminação da infecção. Dependendo do tipo de infecção, os anticorpos estarão presentes por muitos meses; às vezes, podem estar presentes pelo resto da vida do paciente. Assim, um teste positivo baseado em anticorpos significa apenas que o paciente foi infectado em algum momento; isso não prova que a infecção esteja ativa.

Além de seu papel no diagnóstico, os antissoros policlonais podem ativar o complemento, detectar a presença de bactérias em ambientes clínicos e da indústria alimentícia e realizar uma ampla variedade de reações de precipitação que podem detectar e quantificar proteínas séricas, vírus ou outros antígenos. No entanto, com as muitas especificidades do anticorpo presente em um antissoro policlonal, há uma probabilidade significativa de que o antissoro reaja de forma cruzada com antígenos aos quais o indivíduo nunca foi exposto. Portanto, devemos sempre considerar a possibilidade de resultados falso-positivos ao trabalhar com um antissoro policlonal.

Exercício\(\PageIndex{3}\)

1. O que é um falso positivo e quais são algumas das razões pelas quais os falsos positivos ocorrem?
2. O que é um falso negativo e quais são algumas das razões pelas quais os falsos positivos ocorrem?
3. Se um paciente testar negativo em um teste altamente sensível, qual é a probabilidade de a pessoa estar infectada com o patógeno?

Produzindo anticorpos monoclonais

Alguns tipos de ensaios exigem melhor especificidade e afinidade de anticorpos do que as obtidas com um antissoro policlonal. Para atingir essa alta especificidade, todos os anticorpos devem se ligar com alta afinidade a um único epítopo. Essa alta especificidade pode ser fornecida por anticorpos monoclonais (mAbs). A tabela\(\PageIndex{1}\) compara algumas das características importantes dos anticorpos monoclonais e policlonais.

Ao contrário dos anticorpos policlonais, que são produzidos em animais vivos, os anticorpos monoclonais são produzidos in vitro usando técnicas de cultura de tecidos. Os mAbs são produzidos pela imunização de um animal, geralmente um camundongo, várias vezes com um antígeno específico. As células B do baço do animal imunizado são então removidas. Como as células B normais são incapazes de proliferar para sempre, elas são fundidas com células B cancerosas imortais chamadas células de mieloma, para produzir células de hibridoma. Todas as células são então colocadas em um meio seletivo que permite que apenas os hibridomas cresçam; as células do mieloma não fundido não podem crescer e quaisquer células B não fundidas morrem. Os hibridomas, que são capazes de crescer continuamente em cultura enquanto produzem anticorpos, são então rastreados para o mAb desejado. Aqueles que produzem o mAb desejado são cultivados em cultura de tecidos; o meio de cultura é colhido periodicamente e os mAbs são purificados do meio. Esse é um processo muito caro e demorado. Pode levar semanas de cultura e muitos litros de mídia para fornecer mABs suficientes para um experimento ou para tratar um único paciente. Os mABs são caros (Figura\(\PageIndex{3}\)).

Figura\(\PageIndex{3}\): Os anticorpos monoclonais (mAbs) são produzidos pela introdução de um antígeno em um camundongo e, em seguida, pela fusão de células B policlonais do baço do camundongo com células de mieloma. As células de hibridoma resultantes são cultivadas e continuam a produzir anticorpos contra o antígeno. Os hibridomas que produzem o mAb desejado são então cultivados em grande número em um meio seletivo que é colhido periodicamente para obter os mAbs desejados.

Tabela\(\PageIndex{1}\): Características dos anticorpos policlonais e monoclonais

Anticorpos monoclonais	Anticorpos policlonais
Produção cara	Produção barata
Longo tempo de produção	Produção rápida
Grandes quantidades de anticorpos específicos	Grandes quantidades de anticorpos não específicos
Reconhecer um único epítopo em um antígeno	Reconhecer vários epítopos em um antígeno
A produção é contínua e uniforme quando o hibridoma é feito	Diferentes lotes variam em composição

Usos clínicos de anticorpos monoclonais

Como os métodos mais comuns de produção de anticorpos monoclonais usam células de camundongos, é necessário criar anticorpos monoclonais humanizados para uso clínico humano. Os anticorpos de camundongos não podem ser injetados repetidamente em humanos, porque o sistema imunológico os reconhecerá como estranhos e responderá a eles com anticorpos neutralizantes. Esse problema pode ser minimizado pela engenharia genética do anticorpo na célula B do camundongo. As regiões variáveis dos genes de cadeia leve e pesada do camundongo são ligadas às regiões constantes humanas, e o gene quimérico é então transferido para uma célula hospedeira. Isso permite a produção de um mAb que é principalmente “humano”, com apenas o local de ligação ao antígeno sendo de origem de camundongo.

Os mAbs humanizados têm sido usados com sucesso para tratar o câncer com efeitos colaterais mínimos. Por exemplo, o anticorpo monoclonal humanizado Herceptin tem sido útil no tratamento de alguns tipos de câncer de mama. Também houve alguns ensaios preliminares de mAb humanizado para o tratamento de doenças infecciosas, mas nenhum desses tratamentos está em uso atualmente. Em alguns casos, os mAbs se mostraram muito específicos para tratar doenças infecciosas, porque reconhecem alguns sorovares de um patógeno, mas não outros. Usar um coquetel de vários mABs que visam diferentes cepas do patógeno pode resolver esse problema. No entanto, o grande custo associado à produção de mAb é outro desafio que impediu que o mAbs se tornasse prático para uso no tratamento de infecções microbianas. ¹

Uma tecnologia promissora para mAbs baratos é o uso de plantas geneticamente modificadas para produzir anticorpos (ou plantcorpos). Essa tecnologia transforma as células vegetais em fábricas de anticorpos, em vez de depender de células de cultura de tecidos, que são caras e tecnicamente exigentes. Em alguns casos, pode até ser possível administrar esses anticorpos fazendo com que os pacientes comam as plantas, em vez de extrair e injetar os anticorpos. Por exemplo, em 2013, um grupo de pesquisa clonou genes de anticorpos em plantas que tinham a capacidade de neutralizar uma importante toxina de uma bactéria que pode causar doenças gastrointestinais graves. ² Comer as plantas pode potencialmente liberar os anticorpos diretamente para a toxina.

Exercício\(\PageIndex{4}\)

1. Como os anticorpos monoclonais humanizados são produzidos?
2. O que significa “monoclonal” dos anticorpos monoclonais?

Usando anticorpos monoclonais para combater o Ebola

Durante o surto de Ebola de 2014-2015 na África Ocidental, alguns pacientes infectados com ebola foram tratados com ZMapp, um medicamento que se mostrou eficaz em testes realizados em macacos rhesus apenas alguns meses antes. ³ ZMapp é uma combinação de três mAbs produzidos pela incorporação dos genes de anticorpos em plantas de tabaco usando um vetor viral. Ao usar três mAbs, o medicamento é eficaz em várias cepas do vírus. Infelizmente, havia apenas ZMapp suficiente para tratar um pequeno número de pacientes.

Embora a tecnologia atual não seja adequada para produzir grandes quantidades de ZMapp, ela mostra que os plantcorpos - MABs produzidos em plantas - são viáveis para uso clínico, potencialmente econômicos e merecem um maior desenvolvimento. Nos últimos anos, houve uma explosão no número de novos medicamentos à base de Mab para o tratamento de câncer e doenças infecciosas; no entanto, o uso generalizado desses medicamentos é atualmente inibido por seu custo exorbitante, especialmente em partes subdesenvolvidas do mundo, onde uma única dose pode custar mais do que a renda vitalícia do paciente. O desenvolvimento de métodos para clonar genes de anticorpos em plantas pode reduzir drasticamente os custos.

Conceitos principais e resumo

• Os anticorpos se ligam com alta especificidade aos antígenos usados para desafiar o sistema imunológico, mas também podem mostrar reatividade cruzada ao se ligarem a outros antígenos que compartilham propriedades químicas com o antígeno original.
• A injeção de um antígeno em um animal resultará em uma resposta de anticorpo policlonal na qual são produzidos diferentes anticorpos que reagem com os vários epítopos do antígeno.
• Os antissoros policlonais são úteis para alguns tipos de ensaios laboratoriais, mas outros ensaios exigem mais especificidade. Os testes de diagnóstico que usam antissoros policlonais são normalmente usados apenas para rastreamento devido à possibilidade de resultados falsos positivos e falsos negativos.
• Os anticorpos monoclonais fornecem maior especificidade do que os antissoros policlonais porque se ligam a um único epítopo e geralmente têm alta afinidade.
• Os anticorpos monoclonais são normalmente produzidos pelo cultivo de hibridomas secretores de anticorpos derivados de camundongos. Atualmente, os mABs são usados para tratar câncer, mas seu custo exorbitante os impediu de serem usados mais amplamente para tratar doenças infecciosas. Ainda assim, seu potencial para uso laboratorial e clínico está impulsionando o desenvolvimento de novas soluções econômicas, como plantcorpos.

Notas de pé

1. 1 Saylor, Carolyn, Ekaterina Dadachova e Arturo Casadevall, “Terapias baseadas em anticorpos monoclonais para doenças microbianas”, Vacina 27 (2009): G38-G46.
2. 2 Nakanishi, Katsuhiro et al., “Produção de plantcorpos híbridos de IgG/IgA com atividade neutralizante contra a toxina Shiga 1”, PLoS One 8, nº 11 (2013): e80712.
3. 3 Qiu, Xiangguo et al., “Reversão da doença avançada do vírus Ebola em primatas não humanos com ZMapp”, Nature 514 (2014): 47—53.