9.2: Exigências de oxigênio para o crescimento microbiano

objetivos de aprendizagem

• Interprete dados visuais demonstrando requisitos mínimos, ótimos e máximos de oxigênio ou dióxido de carbono para o crescimento
• Identifique e descreva diferentes categorias de micróbios com necessidades de crescimento com ou sem oxigênio: aeróbio obrigatório, anaeróbio obrigatório, anaeróbio facultativo, anaeróbio aerotolerante, microaerófilo e capnófilo
• Dê exemplos de microrganismos para cada categoria de requisitos de crescimento

Pergunte à maioria das pessoas “Quais são os principais requisitos para a vida?” e as respostas provavelmente incluirão água e oxigênio. Poucos discutiriam sobre a necessidade de água, mas e quanto ao oxigênio? Pode haver vida sem oxigênio?

A resposta é que o oxigênio molecular (O ₂) nem sempre é necessário. Os primeiros sinais de vida datam de um período em que as condições na Terra eram altamente reduzidas e o gás oxigênio livre era essencialmente inexistente. Somente depois que as cianobactérias começaram a liberar oxigênio como subproduto da fotossíntese e a capacidade do ferro nos oceanos de absorver oxigênio foi esgotada, os níveis de oxigênio aumentaram na atmosfera. Esse evento, muitas vezes chamado de Grande Evento de Oxigenação ou Revolução do Oxigênio, causou uma extinção massiva. A maioria dos organismos não sobreviveu às poderosas propriedades oxidativas das espécies reativas de oxigênio (ROS), íons altamente instáveis e moléculas derivadas da redução parcial do oxigênio que podem danificar praticamente qualquer macromolécula ou estrutura com a qual entrem em contato. Oxigênio simples (O ₂ •), superóxido\((\ce{O2-})\), peróxidos (H ₂ O ₂), radical hidroxila (OH•) e íon hipoclorito (OCl ⁻), o ingrediente ativo da lixívia doméstica, são todos exemplos de ROS. Os organismos que conseguiram desintoxicar espécies reativas de oxigênio aproveitaram a alta eletronegatividade do oxigênio para produzir energia livre para seu metabolismo e prosperaram no novo ambiente.

Requisitos de oxigênio dos microrganismos

Muitos ecossistemas ainda estão livres de oxigênio molecular. Alguns são encontrados em locais extremos, como nas profundezas do oceano ou na crosta terrestre; outros fazem parte de nossa paisagem cotidiana, como pântanos, pântanos e esgotos. Dentro dos corpos de humanos e outros animais, regiões com pouco ou nenhum oxigênio fornecem um ambiente anaeróbico para os microrganismos. (Figura\(\PageIndex{1}\)).

Figura\(\PageIndex{1}\): Ambientes anaeróbicos ainda são comuns na Terra. Eles incluem ambientes como (a) um pântano onde sedimentos densos não perturbados são virtualmente desprovidos de oxigênio e (b) o rúmen (o primeiro compartimento do estômago de uma vaca), que fornece uma incubadora sem oxigênio para metanógenos e outras bactérias anaeróbicas obrigatórias. (crédito a: modificação do trabalho pelo National Park Service; crédito b: modificação do trabalho pelo Departamento de Agricultura dos EUA)

Podemos facilmente observar diferentes requisitos de oxigênio molecular cultivando bactérias em culturas de tubos de tioglicolato. Uma cultura em tubo de ensaio começa com meio de tioglicolato autoclavado contendo uma baixa porcentagem de ágar para permitir que bactérias móveis se movam por todo o meio. O tioglicolato tem fortes propriedades redutoras e a autoclavagem libera a maior parte do oxigênio. Os tubos são inoculados com as culturas bacterianas para serem testados e incubados a uma temperatura apropriada. Com o tempo, o oxigênio se difunde lentamente pela cultura do tubo de tioglicolato a partir do topo. A densidade bacteriana aumenta na área em que a concentração de oxigênio é mais adequada para o crescimento desse organismo em particular.

O crescimento de bactérias com diferentes necessidades de oxigênio em tubos de tioglicolato é ilustrado na Figura\(\PageIndex{2}\). No tubo A, todo o crescimento é visto na parte superior do tubo. As bactérias são aeróbios obrigatórios (estritos) que não podem crescer sem um suprimento abundante de oxigênio. O tubo B parece o oposto do tubo A. As bactérias crescem na parte inferior do tubo B. Esses são anaeróbios obrigatórios, que são mortos pelo oxigênio. O tubo C mostra um crescimento intenso na parte superior do tubo e crescimento em todo o tubo, um resultado típico com anaeróbios facultativos. Anaeróbios facultativos são organismos que prosperam na presença de oxigênio, mas também crescem em sua ausência por meio da fermentação ou da respiração anaeróbica, se houver um aceitador de elétrons adequado além do oxigênio e o organismo for capaz de realizar respiração anaeróbica. Os anaeróbios aerotolerantes no tubo D são indiferentes à presença de oxigênio. Eles não usam oxigênio porque geralmente têm um metabolismo fermentativo, mas não são prejudicados pela presença de oxigênio, como os anaeróbios obrigatórios. O tubo E à direita mostra a cultura “Cachinhos Dourados”. O nível de oxigênio deve ser perfeito para o crescimento, nem demais nem muito pouco. Esses microaerófilos são bactérias que requerem um nível mínimo de oxigênio para crescer, cerca de 1% a 10%, bem abaixo dos 21% encontrados na atmosfera.

Exemplos de aeróbios obrigatórios são o Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose, e o Micrococcus luteus, uma bactéria gram-positiva que coloniza a pele. Neisseria meningitidis, agente causador da meningite bacteriana grave, e N. gonorrheae, agente causador da gonorreia sexualmente transmissível, também são aeróbios obrigatórios.

Figura\(\PageIndex{2}\): Diagrama da distribuição das células bacterianas em tubos de tioglicolato.

Muitos anaeróbios obrigatórios são encontrados no ambiente onde existem condições anaeróbicas, como em sedimentos profundos do solo, águas calmas e no fundo do oceano profundo, onde não há vida fotossintética. As condições anaeróbicas também existem naturalmente no trato intestinal dos animais. Os anaeróbios obrigatórios, principalmente os bacteroidetes, representam uma grande fração dos micróbios no intestino humano. Existem condições anaeróbicas transitórias quando os tecidos não recebem circulação sanguínea; eles morrem e se tornam um terreno fértil ideal para anaeróbios obrigatórios. Outro tipo de anaeróbio obrigatório encontrado no corpo humano é o Clostridium spp gram-positivo em forma de bastonete. Sua capacidade de formar endósporos permite que eles sobrevivam na presença de oxigênio. Uma das principais causas de infecções adquiridas em saúde é a C. difficile, conhecida como C. diff. O uso prolongado de antibióticos para outras infecções aumenta a probabilidade de um paciente desenvolver uma infecção secundária por C. difficile. O tratamento com antibióticos interrompe o equilíbrio dos microrganismos no intestino e permite a colonização do intestino por C. difficile, causando uma inflamação significativa do cólon.

Outros clostrídios responsáveis por infecções graves incluem C. tetani, o agente do tétano, e C. perfringens, que causa gangrena gasosa. Em ambos os casos, a infecção começa no tecido necrótico (tecido morto que não é fornecido com oxigênio pela circulação sanguínea). Essa é a razão pela qual feridas de punção profunda estão associadas ao tétano. Quando a morte do tecido é acompanhada por falta de circulação, a gangrena é sempre um perigo.

O estudo dos anaeróbios obrigatórios requer equipamento especial. As bactérias anaeróbicas obrigatórias devem ser cultivadas em condições desprovidas de oxigênio. A abordagem mais comum é a cultura em uma jarra anaeróbica (Figura\(\PageIndex{3}\)). Os frascos anaeróbicos incluem embalagens químicas que removem oxigênio e liberam dióxido de carbono (CO ₂). Uma câmara anaeróbica é uma caixa fechada da qual todo o oxigênio é removido. Luvas seladas nas aberturas da caixa permitem o manuseio das culturas sem expor a cultura ao ar (Figura\(\PageIndex{3}\)).

Figura\(\PageIndex{3}\): (a) Uma jarra anaeróbica é retratada com nove placas de Petri que sustentam culturas. (b) As aberturas na lateral de uma caixa anaeróbica são seladas por mangas em forma de luva que permitem o manuseio de culturas dentro da caixa. (crédito a: modificação do trabalho dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças; crédito b: modificação do trabalho pelo NIST)

Staphylococci e Enterobacteriaceae são exemplos de anaeróbios facultativos. Os estafilococos são encontrados na pele e no trato respiratório superior. Enterobacteriaceae são encontradas principalmente no intestino e no trato respiratório superior, mas às vezes podem se espalhar para o trato urinário, onde são capazes de causar infecções. Não é incomum ver infecções bacterianas mistas nas quais os anaeróbios facultativos consomem o oxigênio, criando um ambiente para o florescimento dos anaeróbios obrigatórios.

Exemplos de anaeróbios aerotolerantes incluem lactobacilos e estreptococos, ambos encontrados na microbiota oral. O Campylobacter jejuni, que causa infecções gastrointestinais, é um exemplo de microaerófilo e é cultivado em condições de baixo oxigênio.

A concentração ideal de oxigênio, como o nome indica, é a concentração ideal de oxigênio para um determinado microrganismo. A menor concentração de oxigênio que permite o crescimento é chamada de concentração mínima permissiva de oxigênio. A maior concentração tolerada de oxigênio é a concentração máxima permissiva de oxigênio. O organismo não crescerá fora da faixa de níveis de oxigênio encontrados entre as concentrações permissivas mínimas e máximas de oxigênio.

Exercício\(\PageIndex{1}\)

1. Você esperaria que as linhagens bacterianas mais antigas fossem aeróbicas ou anaeróbicas?
2. Quais bactérias crescem na parte superior de um tubo de tioglicolato e quais crescem na parte inferior do tubo?

Um anaeróbio indesejável

Charles é um motorista de ônibus aposentado que desenvolveu diabetes tipo 2 há mais de 10 anos. Desde sua aposentadoria, seu estilo de vida se tornou muito sedentário e ele ganhou uma quantidade substancial de peso. Embora tenha sentido formigamento e dormência no pé esquerdo por um tempo, ele não se preocupou porque achava que seu pé estava simplesmente “adormecendo”. Recentemente, um arranhão em seu pé não parece estar curando e está ficando cada vez mais feio. Como a ferida não o incomodava muito, Charles percebeu que não poderia ser grave até que sua filha percebeu uma descoloração arroxeada se espalhando pela pele e escorrendo (Figura\(\PageIndex{4}\)). Quando foi finalmente atendido por seu médico, Charles foi levado às pressas para a sala de cirurgia. Sua ferida aberta, ou úlcera, é o resultado de um pé diabético.

A preocupação aqui é que a gangrena gasosa pode ter se apoderado do tecido morto. O agente mais provável da gangrena gasosa é o Clostridium perfringens, uma bactéria gram-positiva formadora de endosporos. É um anaeróbio obrigatório que cresce em tecidos desprovidos de oxigênio. Como o tecido morto não é mais abastecido com oxigênio pelo sistema circulatório, o tecido morto fornece bolsas de ambiente ideal para o crescimento de C. perfringens.

Um cirurgião examina a úlcera e as radiografias do pé de Charles e determina que o osso ainda não está infectado. A ferida deverá ser desbridada cirurgicamente (o desbridamento se refere à remoção de tecido morto e infectado) e uma amostra enviada para análise microbiológica em laboratório, mas Charles não precisará ter seu pé amputado. Muitos pacientes diabéticos não têm tanta sorte. Em 2008, quase 70.000 pacientes diabéticos nos Estados Unidos perderam um pé ou membro devido à amputação, de acordo com estatísticas dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

Figura\(\PageIndex{4}\): Esta foto clínica mostra úlceras no pé de um paciente diabético. O tecido morto acumulado nas úlceras pode fornecer um ambiente de crescimento ideal para o anaeróbio C. perfringens, um agente causador da gangrena gasosa. (crédito: Shigeo Kono, Reiko Nakagawachi, Jun Arata, Benjamin A Lipsky)

Exercício\(\PageIndex{2}\)

Quais condições de crescimento você recomendaria para a detecção de C. perfringens?

Desintoxicação de espécies reativas de oxigênio

A respiração aeróbica gera constantemente espécies reativas de oxigênio (ROS), subprodutos que devem ser desintoxicados. Mesmo organismos que não usam respiração aeróbica precisam de alguma forma de decompor algumas das ROS que podem se formar a partir do oxigênio atmosférico. Três enzimas principais decompõem esses subprodutos tóxicos: superóxido dismutase, peroxidase e catalase. Cada um catalisa uma reação diferente. As reações do tipo visto na Reação 1 são catalisadas por peroxidases.

\[\mathrm{X-(2H^+)+H_2O_2 \rightarrow \text{oxidized-}X+2H_2O}\]

Nessas reações, um doador de elétrons (composto reduzido; por exemplo, dinucleotídeo reduzido de nicotinamida adenina [NADH]) oxida o peróxido de hidrogênio ou outros peróxidos na água. As enzimas desempenham um papel importante ao limitar os danos causados pela peroxidação dos lipídios da membrana. A reação 2 é mediada pela enzima superóxido dismutase (SOD) e decompõe os poderosos ânions superóxido gerados pelo metabolismo aeróbico:

\[\mathrm{2O_2^- + 2H^+ \rightarrow H_2O_2+O_2}\]

A enzima catalase converte o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, conforme mostrado na Reação 3.

\[\mathrm{2H_2O_2 \rightarrow 2H_2O+O_2}\]

Os anaeróbios obrigatórios geralmente não possuem as três enzimas. Os anaeróbios aerotolerantes têm SOD, mas não catalase. A reação 3, mostrada na Figura\(\PageIndex{5}\), é a base de um teste útil e rápido para distinguir estreptococos, que são aerotolerantes e não possuem catalase, dos estafilococos, que são anaeróbios facultativos. Uma amostra de cultura rapidamente misturada em uma gota de 3% de peróxido de hidrogênio liberará bolhas se a cultura for catalase positiva.

Figura\(\PageIndex{5}\): O teste da catalase detecta a presença da enzima catalase observando se as bolhas são liberadas quando o peróxido de hidrogênio é adicionado a uma amostra de cultura. Compare o resultado positivo (à direita) com o resultado negativo (à esquerda). (crédito: Centros de Controle e Prevenção de Doenças)

As bactérias que crescem melhor em uma concentração maior de CO ₂ e uma menor concentração de oxigênio do que as presentes na atmosfera são chamadas de capnófilos. Uma abordagem comum para cultivar capnófilos é usar um frasco de velas. Um frasco de vela consiste em um frasco com uma tampa bem ajustada que pode acomodar as culturas e uma vela. Depois que as culturas são adicionadas ao frasco, a vela é acesa e a tampa fechada. Quando a vela queima, ela consome a maior parte do oxigênio presente e libera CO ₂.

Exercício\(\PageIndex{3}\)

1. Qual substância é adicionada a uma amostra para detectar a catalase?
2. Qual é a função da vela em uma jarra de velas?

Foco clínico: Parte 2

O profissional de saúde que atendeu Jeni ficou preocupado principalmente por causa de sua gravidez. Sua condição aumenta o risco de infecções e a torna mais vulnerável a essas infecções. O sistema imunológico é regulado negativamente durante a gravidez e os patógenos que atravessam a placenta podem ser muito perigosos para o feto. Uma nota sobre o pedido do provedor ao laboratório de microbiologia menciona uma suspeita de infecção por Listeria monocytogenes, com base nos sinais e sintomas exibidos pelo paciente.

As amostras de sangue de Jeni são colocadas diretamente no ágar de sangue de ovelha, um meio contendo ágar tríptico de soja enriquecido com 5% de sangue de ovelha. (O sangue é considerado estéril; portanto, microrganismos concorrentes não são esperados no meio.) As placas inoculadas são incubadas a 37 °C por 24 a 48 horas. Surgem pequenas colônias acinzentadas cercadas por uma zona clara. Essas colônias são típicas da Listeria e de outros patógenos, como estreptococos; a zona clara ao redor das colônias indica lise completa do sangue no meio, conhecida como beta-hemólise (Figura\(\PageIndex{6}\)). Quando testadas quanto à presença de catalase, as colônias dão uma resposta positiva, eliminando o Streptococcus como uma possível causa. Além disso, uma coloração de Gram mostra bacilos gram-positivos curtos. Células de uma cultura de caldo cultivada em temperatura ambiente exibiram a motilidade tombante característica da Listeria (Figura\(\PageIndex{6}\)). Todas essas pistas levam o laboratório a confirmar positivamente a presença de Listeria nas amostras de sangue de Jeni.

Figura\(\PageIndex{6}\): (a) Uma amostra de teste de ágar no sangue mostrando beta-hemólise. (b) Um teste de motilidade da amostra mostrando resultados positivos e negativos. (crédito a: modificação do trabalho dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças; crédito b: modificação do trabalho pelo “VeeDunn” /Flickr)

Exercício\(\PageIndex{4}\)

Qual é a gravidade da condição de Jeni e qual é o tratamento adequado?

Conceitos principais e resumo

• Ambientes aeróbicos e anaeróbicos podem ser encontrados em diversos nichos da natureza, incluindo diferentes locais dentro e fora do corpo humano.
• Os microrganismos variam em suas necessidades de oxigênio molecular. Os aeróbios obrigatórios dependem da respiração aeróbica e usam o oxigênio como um aceitador terminal de elétrons. Eles não podem crescer sem oxigênio.
• Os anaeróbios obrigatórios não podem crescer na presença de oxigênio. Eles dependem da fermentação e da respiração anaeróbica usando um aceitador final de elétrons diferente do oxigênio.
• Os anaeróbios facultativos mostram melhor crescimento na presença de oxigênio, mas também crescerão sem ele.
• Embora os anaeróbios aerotolerantes não realizem respiração aeróbica, eles podem crescer na presença de oxigênio. A maioria dos anaeróbios aerotolerantes testam negativo para a enzima catalase.
• Os microaerófilos precisam de oxigênio para crescer, embora em uma concentração menor do que 21% de oxigênio no ar.
• A concentração ideal de oxigênio para um organismo é o nível de oxigênio que promove a taxa de crescimento mais rápida. A concentração mínima permissiva de oxigênio e a concentração máxima permissiva de oxigênio são, respectivamente, os níveis mais baixos e mais altos de oxigênio que o organismo tolerará.
• A peroxidase, a superóxido dismutase e a catalase são as principais enzimas envolvidas na desintoxicação das espécies reativas de oxigênio. A superóxido dismutase geralmente está presente em uma célula que pode tolerar oxigênio. Todas as três enzimas geralmente são detectáveis em células que realizam respiração aeróbica e produzem mais ROS.
• Um capnófilo é um organismo que requer uma concentração de CO ₂ maior que a atmosférica para crescer.

Notas de pé

1. 1 Centros de Controle e Prevenção de Doenças. “Viver com diabetes: mantenha seus pés saudáveis”. http://www.cdc.gov/Features/DiabetesFootHealth/