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20.4：酶免疫测定（EIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）

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    学习目标

    • 解释 EIA、FEIA 和 ELISA 之间的区别和相似之处
    • 描述免疫组织化学和免疫细胞化学之间的区别和相似之处
    • 描述直接和间接 ELISA 的不同目的

    与 Western blot 类似，酶免疫测定 (EIA) 使用抗体来检测抗原的存在。 但是，EIA 与 Western blots 的不同之处在于，测定是在微量滴定板或体内进行的，而不是在吸收膜上进行的。 EIA有许多不同类型，但它们都涉及一种抗体分子，其恒定区域与酶结合，使可变区域自由结合其特异性抗原。 为该酶添加底物可以对抗原进行可视化或量化（图\(\PageIndex{1}\)）。

    在环境影响评估中，酶的底物通常是染色体，一种转化为彩色最终产物的无色分子。 最广泛使用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，其合适的底物很容易获得。 在一些环境影响评估中，底物是氟素，一种非荧光分子，酶会将其转化为荧光形式。 使用氟原的环境影响评估被称为荧光酶免疫测定（FEIA）。 荧光可以通过荧光显微镜或分光光度计进行检测。

    病毒抗原（绘制成钻石）附着在表面上。 附有酶偶联物（紫色圆圈）的抗体（以 Y 绘制）与病毒抗原结合。 底物（画成蓝色圆圈）与抗体上的酶相互作用并改变颜色以进行检测。
    图\(\PageIndex{1}\)：酶免疫测定，例如此处显示的直接ELISA，使用酶抗体偶联物将可检测的底物输送到抗原部位。 底物可以是转化为彩色最终产物的无色分子，也可以是酶活后会发出荧光的非活性荧光分子。 （来源：“Cavitri” /Wikimedia Commons 对作品的修改）

    MMR 滴度

    麻疹、腮腺炎和风疹（德国麻疹）疫苗是一种联合疫苗，可提供针对麻疹、腮腺炎和风疹（德国麻疹）的保护。 大多数人在儿童时期接种麻疹混合疫苗，因此具有针对这些疾病的抗体。 但是，由于各种原因，即使是接种疫苗的人也可能在以后的生活中再次感染这些疾病。 例如，有些儿童可能只接种一轮 MMR 疫苗，而不是推荐的两轮。 此外，个人体内保护性抗体的滴度可能会随着年龄的增长或某些疾病而开始下降。

    为了确定个人血液中的抗体滴度是否足以提供保护，可以进行 MMR 滴度测试。 该测试是一种简单的免疫测定，可以用血液样本快速完成。 测试结果将表明该人是否仍然具有免疫力或需要另一剂MMR疫苗。

    对于医护人员，尤其是那些经常与幼儿或免疫功能低下患者接触的医护人员，必须服用 MMR 滴度。 如果医护人员感染了麻疹、腮腺炎或风疹，该人很容易将这些疾病传染给易感患者，从而导致疫情。 根据 MMR 滴度的结果，医护人员可能需要在开始工作之前重新接种疫苗。

    免疫染色

    EIA 的一个强大用途是免疫染色，其中抗体酶偶联物可增强显微镜检查。 免疫组织化学（IHC）用于检查整个组织。 如图所示\(\PageIndex{2}\)，可以对一部分组织进行染色以可视化各种细胞类型。 在这个例子中，针对CD8的单克隆抗体被用来染色扁桃体组织中的CD8细胞。 现在可以计算CD8细胞的数量，确定它们与存在的其他细胞类型的相对数量，并确定这些细胞在该组织中的位置。 此类数据将有助于研究艾滋病等疾病，在这些疾病中，CD8细胞的正常功能对于减缓疾病进展至关重要。

    免疫细胞化学（ICC）是另一种有价值的免疫染色形式。 虽然与 IHC 类似，但在 ICC 中，细胞外基质材料会被剥离，细胞膜用酒精蚀以使其对抗体具有渗透性。 这允许抗体穿过细胞膜并与细胞内的特定靶点结合。 细胞器、细胞骨架成分和其他细胞内结构可以通过这种方式可视化。 虽然某些ICC技术使用EIA，但该酶可以被荧光分子所取代，使其成为一种荧光免疫测定。

    标有 CD8 细胞的棕色圆形细胞的显微照片。
    图\(\PageIndex{2}\)：在使用染色原制备骨髓时，使用了针对 CD8 的酶联抗体来染色 CD8 细胞。 （来源：修改了 Yamashita M、Fujii Y、Ozaki K、Urano Y、Iwasa M、Nakamura S、Fujii S、Abe M、Sato Y、Yoshino T 的作品）

    练习\(\PageIndex{1}\)

    1. 免疫组织化学和免疫细胞化学有什么区别？
    2. 免疫组织化学中使用的酶促反应的产物一定是正确的？

    酶联免疫吸附试验 (ELISA)

    酶联免疫吸附试验（ELISA）是广泛使用的环境影响评估。 在直接ELISA中，抗原被固定在微量滴定板的孔中。 在每个孔中添加一种对特定抗原具有特异性并与酶偶联的抗体。 如果存在抗原，则抗体将结合。 清洗去除任何未结合的抗体后，添加无色底物（chromogen）。 该酶的存在会将底物转化为有色的最终产物（图\(\PageIndex{1}\)）。 虽然这种技术速度更快，因为它只需要使用一种抗体，但它的缺点是来自直接ELISA的信号较低（灵敏度较低）。

    在三明治 ELISA 中，目标是使用抗体精确量化溶液中存在的特定抗原，例如来自病原体的抗原、血清蛋白或血液或尿液中的激素，仅举几个例子。 三明治 ELISA 的第一步是将初级抗体添加到微量滴定板的所有孔中（图\(\PageIndex{3}\)）。 抗体通过疏水相互作用粘附在塑料上。 经过适当的孵育时间后，任何未结合的抗体都会被冲走。 在后续的每个步骤之间使用类似的洗涤方式，以确保只有特异结合的分子才会附着在板上。 然后添加阻断蛋白（例如白蛋白或牛奶蛋白酪蛋白），以结合井中剩余的非特异性蛋白结合位点。 一些井将获得已知数量的抗原以构建标准曲线，而其他井中则会添加未知的抗原溶液。 一级抗体捕获抗原，洗涤后添加二级抗体，二级抗体是一种与酶偶联的多克隆抗体。 最后一次洗涤后，添加无色底物（chromogen），然后该酶将其转化为有色的最终产物。 使用分光光度计测量由最终产品引起的样品的颜色强度。 产生的颜色量（以吸光度测量）与酶的量成正比，而酶的量反过来又与捕获的抗原成正比。 ELISA 非常敏感，允许在每 mL 范围内的纳克（10 —9 g）范围内对抗原进行定量。

    在间接ELISA中，我们量化抗原特异性抗体而不是抗原。 我们可以使用间接ELISA来检测针对多种病原体的抗体，包括伯氏疏螺旋体（莱姆病）和艾滋病毒。 间接和直接 ELISA 之间有三个重要区别，如图所示\(\PageIndex{4}\)。 间接ELISA不是使用抗体来捕获抗原，而是首先将已知的抗原（例如来自HIV的肽）附着在微量滴定板孔的底部。 阻断板上未结合的位点后，添加患者血清；如果存在抗体（一级抗体），它们将结合抗原。 冲洗掉任何未结合的蛋白质后，二级抗体及其偶联酶将针对一级抗体（例如抗人免疫球蛋白）。 次级抗体允许我们通过共轭酶-色原反应产生的颜色强度来量化患者血清中存在多少抗原特异性抗体。

    与本章讨论的其他几种抗体测试一样，人们一直担心与针对其他抗原的抗体的交叉反应性，这可能会导致假阳性结果。 因此，我们无法根据单一间接ELISA测定来明确诊断HIV感染（或任何其他类型的感染）。 我们必须确认任何疑似阳性检测，通常使用实际识别病原体中存在特定肽的免疫印迹或鉴定与病原体相关的核酸的测试，例如逆转录聚合酶聚合酶链反应（RT-PCR）或核酸抗原测试。

    a) 三明治 ELISA 示意图，显示阳性和阴性样本中会发生的情况。 首先，一级抗体与井结合。 这显示为绑定到表面的 Y。 接下来，添加阻塞代理。 这显示为抗体之间表面上的黑色覆盖物。 接下来，添加样本；如果存在正确的抗原，它会与抗体结合。 在阳性井中，一个圆圈与抗体结合；在阴性井中，没有任何东西与抗体结合。 接下来，任何未绑定的样本都被冲走。 接下来，添加抗体-酶偶联物。 这以正数和另一个 Y 形显示，它与圆圈绑定在一起。 这个新的 Y 形末端有一个紫色圆圈。 这些抗体也存在于阴性样本中，但它们不附着在任何东西上。 接下来，未结合的抗体-酶偶联物被冲走；它们留在阳性样本中（因为它们附着在抗原上），但在阴性样本中被冲走。 最后，在阳性和阴性样品中都添加了衬底。 阳性样本中的酶会使该底物变为蓝色。b) 一块有许多孔的塑料板。 有些是透明的，有些是蓝色的。
    图\(\PageIndex{3}\)：(a) 在三明治 ELISA 中，使用一级抗体首先捕获具有一级抗体的抗原。 添加了与酶偶联的二级抗体，该酶还可以识别抗原上的表位。 添加色素后，分光光度计测量最终产物的吸光度，吸光度与捕获的抗原量成正比。 (b) ELISA 板显示抗体（左）和抗原（下图）的稀释情况。 浓度越高，最终颜色越深。 （来源 b：美国鱼类和野生动物管理局太平洋地区对作品的修改）
    间接ELISA示意图显示了阳性和阴性样本中会发生的情况。 首先，抗原与井结合。 这显示为正孔和负孔表面的钻石。 接下来，添加阻塞代理。 这显示为抗原之间表面上的黑色覆盖物。 接下来，添加示例。 如果存在正确的抗体，它会与抗原结合。 这在正井和负井中均显示为 Y。 否则，没有任何东西与抗原结合。 接下来，任何未绑定的样本都被冲走。 在阳性井中，有一种抗体与抗原结合，在阴性井中，没有任何与抗原结合的抗体。 接下来，添加抗人酶联抗体。 这显示为 Y，两个井中都有一个紫色圆圈。 接下来，将未结合的抗原洗掉。 在阳性样本中，该Y仍与旧抗体结合。 在负面井中，它已不存在。 最后，将基质添加到两口井中。 在阳性井中，酶将底物变为蓝色。
    图\(\PageIndex{4}\)：间接ELISA用于量化患者血清中的抗原特异性抗体，用于疾病诊断。 来自疑似病原体的抗原附着在微量滴定板上。 一级抗体来自患者的血清，随后被酶偶联的二级抗体结合。 测量最终产品的产量使我们能够检测或量化患者血清中存在的抗原特异性抗体的数量。

    练习\(\PageIndex{2}\)

    1. 直接ELISA中二级抗体的目的是什么？
    2. 直接和间接的ELISA量化了什么？

    临床重点：第 2 部分

    尽管联系1300名患者并对其进行HIV检测既费时又昂贵，但管理人员希望通过主动寻找和治疗流氓员工犯罪的潜在受害者来最大限度地减少医院的责任。 早期发现HIV很重要，及时治疗可以减缓疾病的进展。

    有各种各样的HIV筛查检测，但使用最广泛的是间接ELISA。 与其他间接ELISA一样，该测试的工作原理是将抗原（在本例中为HIV肽）附着在96孔板中的孔中。 如果患者是HIV阳性，则抗HIV抗体将与抗原结合，并通过第二种抗体-酶偶联物进行鉴定。

    练习\(\PageIndex{3}\)

    1. HIV间接ELISA检测的准确性如何？哪些因素会影响检测的准确性？
    2. 医院是否应该使用任何其他测试来确认间接ELISA的结果？

    免疫过滤和免疫层析测定

    在某些情况下，可能需要检测或量化溶液中浓度非常低的抗原或抗体。 为了使之成为可能，已经开发出免疫过滤技术。 在免疫过滤中，大量液体通过多孔膜进入吸收垫。 附着在多孔膜上的抗原将在抗体通过时将其捕获；或者，我们也可以将抗体附着在膜上以捕获抗原。

    免疫过滤方法已应用于免疫层析分析的开发，通常称为横向流动测试或条状试验。 这些测试快速且易于执行，因此非常适合即时使用（即在医生办公室）或在家中使用。 一个例子是TORCH测试，它允许医生筛查孕妇或新生儿是否感染了一系列病毒和其他病原体（弓形虫、其他病毒、风疹、巨细胞病毒、单纯疱疹）。 家用妊娠试验是另一个广泛使用的横向流量测试示例（图\(\PageIndex{5}\)）。 免疫过滤测试在发展中国家也很受欢迎，因为它们价格低廉，不需要持续冷藏干燥的试剂。 但是，该技术也内置在一些先进的实验室设备中。

    在横向流动试验（图\(\PageIndex{6}\)）中，尿液等液体被涂在试纸上的吸收垫上。 液体通过毛细管作用流动，穿过表面附有抗体的珠子条纹。 样品中的液体实际上为试剂补水，试剂以干燥状态存在于条纹中。 由乳胶或微小的金颗粒制成的抗体涂层珠子将结合测试液中的抗原。 然后，抗体-抗原复合物流过第二条条纹，该条带具有针对抗原的固定化抗体；该条纹将保留具有结合抗原的珠子。 第三个控制条带可以绑定任何珠子。 测试线上出现红色（来自金色颗粒）或蓝色（来自乳胶珠）表示检测呈阳性。 如果颜色仅在控制线上出现，则测试结果为阴性。

    与ELISA技术一样，横向流动测试利用抗体三明治，提供灵敏度和特异性。 虽然不像ELISA那样量化，但这些测试具有快速、廉价且不依赖特殊设备的优点。 因此，任何人都可以在任何地方执行它们。 有人担心将如此强大的诊断测试交给可能不了解测试局限性的人手中，例如可能出现假阳性结果。 尽管家庭妊娠试验已被广泛接受，但针对HIV等疾病的居家抗体检测引起了医学界的一些担忧。 有人质疑，在没有能够解释检测结果和下令进行适当确认性检查的医务人员缺席的情况下，是否应该允许自己进行此类检查。 但是，随着越来越多的横向流检测，以及片上实验室技术的快速发展（图 20.1），家庭医学检测在未来可能会变得更加普遍。

    带有 2 条红线的验孕棒；一条标记为测试线，另一条标记为控制线。 摇杆上的一把钥匙上写着 2 行表示怀孕，1 行表示未怀孕
    图\(\PageIndex{5}\)：一项检测尿液中妊娠相关激素的横向流试验。 对照条验证测试的有效性，测试线确定尿液中是否存在与妊娠相关的激素。 （来源：克劳斯·霍夫迈尔对作品的修改）
    该图显示了尿液样本的横向流试验。 顶部面板显示阳性测试，底部显示阴性测试。 在两个样本中都添加了尿液样本；在阳性样本中存在抗原。 标签上写着 hCG 尿液样本涂在吸收性样品垫上。 在这两种情况下，尿液样本都会流经测试区域。 第一个区域是含有 HCG 第二抗体 aunps (HCG-GC) 的混合区域。 然后，它们在两个样本中流过 hCG 条带。 接下来，我们到达测试线。 这里有一些抗体与阳性样本中的抗原结合，但在阴性样本中不结合。 在阳性样本中，HCG-GC 还与抗原结合，在抗原周围形成抗体夹层。 HCG-GC 的存在会导致阳性样本中的颜色变化，但阴性样本不会发生颜色变化。 最后，对照系包含直接结合 hCG-GC 的抗体；因此这些抗体在阳性和阴性样本中均结合。 控制线在两者中都变为一种颜色。
    图\(\PageIndex{6}\)：免疫层析测定或横向流试验，允许在稀溶液中测试抗原。 当液体流过试纸时，它会为试剂补充水分。 偶联到小颗粒的抗体结合第一条带中的抗原，然后流向第二条条纹，在那里它们与第二条固定抗体结合。 这会产生一条颜色线，具体取决于珠子的颜色。 第三，控制条带还会绑定珠子，以表明测试工作正常。 （来源：Yeh CH、Zhao ZQ、Shen PL、Lin YC 对作品的修改）

    练习\(\PageIndex{4}\)

    1. 横向流动法需要什么物理过程才能起作用？
    2. 解释横向流测定中第三条试纸的用途。

    该表\(\PageIndex{1}\)比较了本节讨论的一些环境影响评估的一些关键机制和示例，以及在《检测抗原抗体复合物》中讨论的免疫印迹。

    表\(\PageIndex{1}\)：免疫印迹和酶免疫测定
    测定类型 机制 具体程序 示例
    免疫印迹 使用酶抗体偶联物鉴定已转移到吸收膜的特定蛋白质 Western blot：检测特定蛋白质的存在 检测患者血清中是否存在 HIV 肽（或来自其他传染病原体的肽）
    免疫染色 使用酶抗体偶联物染色细胞上或细胞内的特定分子 免疫组织化学：用于染色组织中的特定细胞 对宿主组织中是否存在 CD8 细胞进行染色
    酶联免疫吸附试验（ELISA） 使用酶抗体偶联物量化靶分子 直接 ELISA：使用单一抗体检测抗原的存在 在感染后一个月内检测出HIV抗原p24
    间接酶联免疫吸附法：测量针对抗原产生的抗体量 检测血清中的 HIV 抗体
    免疫层析（横向流动）检测 技术使用固定抗体捕获流动的、带有颜色标记的抗原抗体复合物进行疾病诊断 三明治 ELISA：测量抗体结合的抗原量 检测患者血清中各种病原体的抗体（例如快速链球菌、疟疾试纸）
    妊娠试验在尿液中检测人绒毛膜促性腺激素

    临床重点：第 3 部分

    尽管HIV的间接ELISA是一种敏感的检测，但有一些复杂的考虑因素。 首先，如果感染者在感染后过早接受检测，则该检测可能会产生假阴性结果。 血清转化窗口通常为三周左右，但在某些情况下，可能超过两个月。

    除了假阴性外，还可能出现误报，这通常是由于先前感染了其他诱发交叉反应抗体的病毒。 假阳性率取决于所使用的特定测试品牌，但0.5％并不罕见。 1 由于可能出现假阳性，所有阳性检测都要进行确认性检测。 这种确认性测试通常是一种免疫印迹（Western blot），其中使用HIV特异性单克隆酶偶联物鉴定患者血液中的HIV肽。 尽管ELISA呈阳性，但阴性印迹将证实HIV感染，而阴性印迹将证实没有HIV。

    不幸的是，HIV抗原的Western blot通常会产生不确定的结果，在这种情况下，它们既不能证实间接ELISA的结果，也不会使结果失效。 实际上，不确定剂的比率可能为10-49％（这就是为什么不使用Western blots进行筛查的原因，再加上其成本）。 与间接ELISA类似，不确定的蛋白质印迹可能由于交叉反应或先前的病毒感染、疫苗接种或自身免疫性疾病而发生。

    练习\(\PageIndex{5}\)

    1. 在接受检测的1300名患者中，预计会有多少假阳性ELISA检测？
    2. 在误报中，预计会有多少不确定的西方污点？
    3. 医院将如何处理任何患者的蛋白质污点不确定的病例？

    关键概念和摘要

    • 酶免疫测定 (EIA) 用于可视化和量化抗原。 他们使用与酶偶联的抗体来结合抗原，然后该酶将底物转化为可观察的最终产物。 底物可以是染色原或氟原。
    • 免疫染色是一种 EIA 技术，用于可视化组织中的细胞（免疫组织化学）或检查细胞内结构（免疫细胞化学）。
    • 直接ELISA 用于量化溶液中的抗原。 一级抗体捕获抗原，二级抗体提供酶。 从显色底物中产生的最终产物与捕获的抗原量成正比。
    • 间接ELISA 用于通过将抗原附在微量滴定板的孔上来检测患者血清中的抗体，从而允许患者（初级）抗体结合抗原和酶偶联二级抗体来检测一级抗体。
    • 免疫过滤和免疫层析测定用于横向流试验，通过检测尿液或其他液体样本中带有颜色标记的抗原抗体复合物，可用于诊断妊娠和各种疾病

    脚注

    1. 1 Thomas、Justin G.、Victor Jaffe、Judith Shaffer 和 Jose Abreu，《艾滋病毒检测：2014 年美国建议》，《整骨疗法家庭医生 6》，第 6 期（2014 年）。