12.2: Kutazama na Tabia ya DNA

Malengo ya kujifunza

• Eleza matumizi ya probes ya asidi ya nucleic ili kutazama utaratibu maalum wa DNA
• Eleza matumizi ya electrophoresis ya gel ili kutenganisha vipande vya DNA
• Eleza kanuni ya kizuizi, urefu wa kipande, uchambuzi wa polymorphism na matumizi yake.
• Kulinganisha na kulinganisha blots Kusini na kaskazini
• Eleza kanuni na matumizi ya uchambuzi wa microarray
• Eleza mbinu zinazotumia kutenganisha na kutazama vigezo vya protini
• Eleza njia na matumizi ya mmenyuko wa mnyororo wa polymerase na mpangilio wa DNA

Mlolongo wa molekuli ya DNA inaweza kutusaidia kutambua kiumbe ikilinganishwa na Utaratibu unaojulikana uliowekwa kwenye database. Mlolongo unaweza pia kutuambia kitu kuhusu kazi ya sehemu fulani ya DNA, kama vile ikiwa inaficha protini fulani. Kulinganisha protini saini-ngazi kujieleza ya arrays maalum ya protini-kati ya sampuli ni njia muhimu kwa ajili ya kutathmini majibu ya seli kwa wingi wa mambo ya mazingira na dhiki. Uchambuzi wa saini za protini unaweza kudhihirisha utambulisho wa kiumbe au jinsi seli inavyoitikia wakati wa ugonjwa.

DNA na protini za riba ni microscopic na kawaida huchanganywa na molekuli nyingine nyingi ikiwa ni pamoja na DNA au protini zisizo na maana kwa maslahi yetu. Mbinu nyingi zimeandaliwa ili kutenganisha na kutambulisha molekuli za maslahi. Mbinu hizi zilianzishwa awali kwa madhumuni ya utafiti, lakini mara nyingi zimekuwa rahisi kwa uhakika kwamba matumizi ya kliniki ya kawaida yanawezekana. Kwa mfano, vimelea vingi, kama vile bakteria Helicobacter pylori, ambayo husababisha vidonda vya tumbo, vinaweza kugunduliwa kwa kutumia vipimo vya protini. Aidha, idadi kubwa ya vipimo maalum na sahihi vya utambulisho wa DNA amplification makao sasa inaweza kuchunguza vimelea kama vile bakteria ya enteric sugu ya antibiotic, virusi vya herpes rahisix, virusi vya varicella-zoster, na wengine wengi.

Uchambuzi wa Masi ya DNA

Katika kifungu hiki, tutaelezea baadhi ya mbinu za msingi zinazotumiwa kutenganisha na kutazama vipande maalum vya DNA ambavyo vina manufaa kwa mwanasayansi. Baadhi ya mbinu hizi hazihitaji ujuzi wa mlolongo kamili wa molekuli ya DNA. Kabla ya ujio wa mpangilio wa haraka wa DNA, mbinu hizi zilikuwa zile pekee zinazopatikana kufanya kazi na DNA, lakini bado zinaunda ghala ya msingi ya zana zilizotumiwa na wataalamu wa maumbile ya Masi kuchunguza majibu ya mwili kwa magonjwa ya microbial na mengine.

Nucleic Acid uchunguzi

Molekuli za DNA ni ndogo, na habari zilizomo katika mlolongo wao hazionekani. Je, mtafiti hutenganaje kunyoosha fulani ya DNA, au kuitenga, kuamua ni viumbe gani kutoka, ni mlolongo gani, au kazi yake ni nini? Njia moja ya kutambua kuwepo kwa mlolongo fulani wa DNA hutumia vipande vilivyotengenezwa kwa hila vya DNA vinavyoitwa probes. Probes zinaweza kutumika kutambua spishi mbalimbali za bakteria katika mazingira na probes nyingi za DNA sasa zinapatikana kuchunguza vimelea kiafya. Kwa mfano, probes ya DNA hutumiwa kuchunguza vimelea vya uke Candida albicans, Gardnerella vaginalis, na Trichomonas vaginalis.

Kwa screen maktaba genomic kwa jeni fulani au mlolongo wa maslahi, watafiti lazima kujua kitu kuhusu jeni kwamba. Ikiwa watafiti wana sehemu ya mlolongo wa DNA kwa jeni la riba, wanaweza kubuni uchunguzi wa DNA, kipande cha DNA kimoja ambacho kinaongezea sehemu ya jeni la riba na tofauti na Utaratibu mwingine wa DNA katika sampuli. Probe ya DNA inaweza kuunganishwa kemikali na maabara ya kibiashara, au inaweza kuundwa kwa cloning, kutenganisha, na denaturing kipande cha DNA kutoka kwa viumbe hai. Katika hali yoyote, uchunguzi DNA lazima kinachoitwa na tag Masi au beacon, kama vile mionzi phosphorus atomi (kama ni kutumika kwa ajili ya autoradiography) au rangi ya umeme (kama ni kutumika katika umeme katika situ hybridization, au SAMAKI), ili uchunguzi na DNA ni kumfunga kwa inaweza kuonekana (Kielelezo \(\PageIndex{1}\)). Sampuli ya DNA inayofanyiwa uchunguzi lazima pia ifanywe denatured ili kuifanya moja-stranded ili uchunguzi wa DNA moja-stranded unaweza anneal kwa sampuli moja stranded DNA katika maeneo ambapo utaratibu wao ni nyongeza. Wakati mbinu hizi ni muhimu kwa ajili ya utambuzi, matumizi yao ya moja kwa moja kwenye sputum na sampuli nyingine za mwili inaweza kuwa tatizo kutokana na hali tata ya sampuli hizi. DNA mara nyingi lazima kwanza kutengwa na sampuli za mwili kupitia mbinu za uchimbaji kemikali kabla ya uchunguzi wa DNA inaweza kutumika kutambua vimelea.

Kielelezo\(\PageIndex{1}\): probes ya DNA inaweza kutumika kuthibitisha uwepo wa pathogen watuhumiwa katika sampuli za mgonjwa. Mchoro huu unaonyesha jinsi probe ya DNA inaweza kutumika kutafuta jeni ya riba inayohusishwa na pathojeni inayoshukiwa.

Mwelekeo wa kliniki: Sehemu ya 2

Dalili kali, kama mafua ambayo Kayla anaipata inaweza kusababishwa na idadi yoyote ya mawakala wa kuambukiza. Aidha, hali kadhaa zisizo za kuambukiza autoimmune, kama vile sclerosis nyingi, lupus erythematosus ya utaratibu (SLE), na sclerosis ya amyotrophic lateral (ALS), pia huwa na dalili zinazofanana na dalili za mwanzo za Kayla. Hata hivyo, kwa kipindi cha wiki kadhaa, dalili za Kayla zilizidi kuwa mbaya zaidi. Alianza kupata maumivu ya pamoja katika magoti yake, palpitations ya moyo, na upungufu wa ajabu katika misuli yake ya uso. Aidha, alipata shida na shingo ngumu na maumivu ya kichwa. Kwa kusita, aliamua ni wakati wa kutafuta matibabu.

Zoezi\(\PageIndex{1}\)

1. Je, dalili mpya za Kayla hutoa dalili yoyote kuhusu aina gani ya maambukizi au hali nyingine ya matibabu anaweza kuwa nayo?
2. Ni vipimo gani au zana ambazo mtoa huduma wa afya anaweza kutumia ili kubainisha pathojeni inayosababisha dalili za Kayla?

Agaroze Gel Electrophoresis

Kuna idadi ya hali ambazo mtafiti anaweza kutaka kimwili kutenganisha mkusanyiko wa vipande vya DNA vya ukubwa tofauti. Mtafiti anaweza pia kuchimba sampuli ya DNA na enzyme ya kizuizi ili kuunda vipande. Ukubwa unaosababisha na muundo wa usambazaji wa kipande unaweza mara nyingi kutoa taarifa muhimu kuhusu mlolongo wa besi za DNA ambazo zinaweza kutumika, kama vile skanati ya bar-code, kutambua mtu binafsi au spishi ambazo DNA ni mali.

Gel electrophoresis ni mbinu ambayo hutumiwa kutenganisha molekuli za kibiolojia kulingana na ukubwa na sifa za biochemical, kama vile malipo na polarity. Agarose electrophoresis ya gel hutumiwa sana kutenganisha DNA (au RNA) ya ukubwa tofauti ambayo inaweza kuzalishwa na digestion ya kizuizi cha enzyme au kwa njia nyingine, kama vile PCR (Kielelezo\(\PageIndex{2}\)).

Kutokana na mgongo wake wa kushtakiwa vibaya, DNA inavutiwa sana na electrode nzuri. Katika agarose gel electrophoresis, gel inaelekezwa kwa usawa katika suluhisho la buffer. Sampuli ni kubeba katika visima sampuli upande wa gel karibu na electrode hasi, kisha inayotolewa kwa njia ya ungo Masi ya tumbo agarose kuelekea electrode chanya. Matrix ya agarose huzuia harakati za molekuli kubwa kupitia gel, wakati molekuli ndogo hupita kwa urahisi zaidi. Hivyo, umbali wa uhamiaji unahusishwa na ukubwa wa kipande cha DNA, na vipande vidogo vinavyosafiri umbali mrefu kupitia gel. Ukubwa wa vipande vya DNA ndani ya sampuli unaweza kukadiriwa kwa kulinganisha na vipande vya ukubwa unaojulikana katika ngazi ya DNA pia huendeshwa kwenye gel moja. Ili kutenganisha vipande kubwa sana vya DNA, kama vile chromosomes au genomes ya virusi, agarose gel electrophoresis inaweza kubadilishwa kwa mara kwa mara kubadilisha mwelekeo wa uwanja wa umeme wakati wa electrophoresis ya gel ya pulsed (PFGE). Katika PFGE, vipande vidogo vinaweza kujielekeza wenyewe na kuhamia kwa kasi kidogo kuliko vipande vikubwa na mbinu hii inaweza kutumika kutenganisha vipande vikubwa sana ambavyo vingeweza kusafiri pamoja wakati wa electrophoresis ya kawaida ya agarose. Katika mbinu yoyote ya electrophoresis, maeneo ya vipande vya DNA au RNA katika gel yanaweza kugunduliwa kwa njia mbalimbali. Njia moja ya kawaida ni kuongeza bromidi ya ethidium, taa inayoingiza ndani ya asidi ya nucleic katika maeneo yasiyo ya maalum na inaweza kuonekana wakati wa mwanga wa ultraviolet. Madoa mengine ambayo ni salama kuliko bromidi ya ethidium, inayoweza kusababisha kansa, sasa inapatikana.

Kielelezo\(\PageIndex{2}\): (a) Mchakato wa electrophoresis ya agarose gel. (b) mtafiti upakiaji sampuli katika gel. (c) Picha hii inaonyesha electrophoresis kukamilika kukimbia kwenye gel agarose. Ngazi ya DNA iko katika vichochoro 1 na 9. Sampuli saba ziko katika vichochoro 2 kwa njia ya 8. Gel ilikuwa imeharibiwa na bromidi ya ethidium na kupiga picha chini ya mwanga wa ultraviolet. (mikopo a: mabadiliko ya kazi na Magnus Manske; mikopo b: mabadiliko ya kazi na Idara ya Kilimo ya Marekani; mikopo c: mabadiliko ya kazi na James Jacob)

Uchambuzi wa Kipande cha Kipande cha Urefu Polymorphism (RFLP)

Uzuiaji maeneo ya utambuzi wa enzyme ni mfupi (tu nucleotides chache kwa muda mrefu), palindromes maalum ya mlolongo, na inaweza kupatikana katika genome. Hivyo, tofauti katika Utaratibu wa DNA katika genomes ya watu binafsi itasababisha tofauti katika usambazaji wa maeneo ya utambuzi wa kizuizo-enzyme ambayo yanaweza kutazamwa kama mifumo tofauti ya banding kwenye gel baada ya agarose electrophoresis ya gel. Uzuiaji kipande urefu polymorphism (RFLP) uchambuzi kulinganisha DNA banding mifumo ya sampuli mbalimbali DNA baada ya kizuizi digestion (Kielelezo\(\PageIndex{3}\)).

Uchunguzi wa RFLP una maombi mengi ya vitendo katika dawa na sayansi ya kuchunguza mauaji. Kwa mfano, epidemiologists hutumia uchambuzi wa RFLP kufuatilia na kutambua chanzo cha vijiumbe maalum vinavyohusishwa na kuzuka kwa sumu ya chakula au magonjwa fulani ya kuambukiza. Uchambuzi wa RFLP pia unaweza kutumika kwenye DNA ya binadamu kuamua mifumo ya urithi wa chromosomes na jeni lahaja, ikiwa ni pamoja na yale yanayohusiana na magonjwa ya urithi au kuanzisha ubaba.

Wanasayansi wa kuchunguza mauaji hutumia uchambuzi wa RFLP kama aina ya uchapishaji wa vidole vya DNA, ambayo ni muhimu kwa kuchambua DNA zilizopatikana kutoka kwenye matukio ya uhalifu, watuhumiwa, na waathirika. Sampuli za DNA zinakusanywa, idadi ya nakala za sampuli za molekuli za DNA zinaongezeka kwa kutumia PCR, halafu zinakabiliwa na digestion ya enzyme ya kizuizi na electrophoresis ya gel ya agarose ili kuzalisha mifumo maalum Kwa kulinganisha mifumo ya banding ya sampuli zilizokusanywa kutoka eneo la uhalifu dhidi ya wale waliokusanywa kutoka kwa watuhumiwa au waathirika, wachunguzi wanaweza kuamua kwa uhakika kama ushahidi wa DNA uliokusanywa katika eneo hilo uliachwa nyuma na watuhumiwa au waathirika.

Kielelezo\(\PageIndex{3}\): RFLP uchambuzi inaweza kutumika kutofautisha Utaratibu DNA. Katika mfano huu, chromosome ya kawaida hupigwa katika vipande viwili, wakati digestion ya chromosome iliyobadilishwa hutoa kipande kimoja tu. Mishale midogo nyekundu inayoelezea makundi mawili tofauti ya kromosomu yanaonyesha maeneo ya maeneo ya kutambua enzyme ya kizuizi. Baada ya digestion na agarose gel electrophoresis, mifumo ya banding huonyesha mabadiliko kwa kuonyesha kupoteza kwa bendi mbili fupi na faida ya bendi ndefu. (mikopo: mabadiliko ya kazi na Kituo cha Taifa cha Taarifa za Bioteknolojia)

Vitalu vya Kusini na Marekebisho

Mbinu kadhaa Masi capitalize juu ya mlolongo mshikamano na hybridization kati ya asidi nucleic ya sampuli na DNA probes. Kwa kawaida, uchunguzi wa sampuli za nucleic-asidi ndani ya gel haukufanikiwa kwa sababu kama uchunguzi wa DNA unaingia ndani ya gel, sampuli ya asidi ya nucleic ndani ya gel huenea nje. Hivyo, mbinu za kuzuia hutumiwa kwa kawaida kuhamisha asidi za nucleic kwenye utando mwembamba, unaofaa wa kushtakiwa uliofanywa na nitrocellulose au nylon. Katika Southern blottechnique, iliyoandaliwa na Sir Edwin Southern mwaka 1975, vipande vya DNA ndani ya sampuli ni kwanza kutengwa na agarose gel electrophoresis na kisha kuhamishiwa kwenye membrane kupitia hatua kapilari (Kielelezo\(\PageIndex{4}\)). Vipande vya DNA vinavyofunga kwenye uso wa membrane vinatambuliwa kwa uchunguzi maalum wa DNA moja iliyopigwa iliyoandikwa na mionzi ya molekuli ya mionzi au ya fluorescent ili kusaidia kugundua. Vitalu vya Kusini vinaweza kutumiwa kuchunguza uwepo wa utaratibu fulani wa DNA katika sampuli iliyotolewa ya DNA. Mara baada ya lengo DNA ndani ya utando ni visualized, watafiti wanaweza kukata sehemu ya utando iliyo na kipande ili kurejesha kipande cha DNA cha riba.

Kielelezo\(\PageIndex{4}\): Katika Southern waa mbinu DNA vipande kwanza kutengwa agarose gel electrophoresis, kisha kuhamishiwa kapilari hatua kwa utando nylon, ambayo ni kisha kulowekwa na uchunguzi DNA tagged na beacon Masi kwa ajili ya taswira rahisi.

Tofauti ya Southern blot-dot waa, yanayopangwa waa, na doa blot-wala kuhusisha electrophoresis, lakini badala yake makini DNA kutoka sampuli katika sehemu ndogo juu ya utando. Baada ya kuchanganyikiwa na uchunguzi wa DNA, kiwango cha ishara kinachogunduliwa kinapimwa, kuruhusu mtafiti kukadiria kiasi cha DNA ya lengo iliyopo ndani ya sampuli.

Msamehevu wa koloni ni tofauti nyingine ya waa la Kusini ambako makoloni yanayowakilisha clones tofauti katika maktaba ya genomic huhamishiwa kwenye utando kwa kusisitiza utando kwenye sahani ya utamaduni. Seli kwenye utando ni lysed na utando unaweza kisha kuchunguzwa ili kuamua ni makoloni gani ndani ya maktaba ya genomic bandari jeni lengo. Kwa sababu makoloni kwenye sahani bado yanaongezeka, seli za riba zinaweza kutengwa na sahani.

Katika waa la kaskazini, tofauti nyingine ya waa ya Kusini, RNA (si DNA) immobilized kwenye membrane na probed. Vitu vya kaskazini hutumika kuchunguza kiasi cha mRNA kilichofanywa kwa njia ya kujieleza jeni ndani ya sampuli ya tishu au viumbe.

Microarray Uchambuzi

Mbinu nyingine ambayo hutaji juu ya mahuluti kati ya utaratibu wa nyongeza ya asidi ya nucleic inaitwa uchambuzi wa microarray. Uchunguzi wa microarray ni muhimu kwa kulinganisha mifumo ya jeni-kujieleza kati ya aina tofauti za kiini-kwa mfano, seli zilizoambukizwa na virusi dhidi ya seli zisizoambukizwa, au seli za kansa dhidi ya seli za afya (Kielelezo\(\PageIndex{5}\)).

Kwa kawaida, DNA au cDNA kutoka sampuli ya majaribio huwekwa kwenye slide ya kioo pamoja na Utaratibu wa DNA unaojulikana. Kila slide inaweza kushikilia zaidi ya 30,000 aina tofauti za kipande cha DNA. Vipande vya DNA tofauti (vinavyozunguka maktaba yote ya genomic ya kiumbe) au vipande vya cDNA (vinavyolingana na inayosaidia kamili ya kiumbe cha jeni zilizoelezwa) vinaweza kuonekana kwa kila mmoja kwenye slide ya kioo.

Mara baada ya zilizoingia kwenye slide, DNA ya genomic au mRNA inaweza kutengwa na sampuli mbili kwa kulinganisha. Kama mRNA ni pekee, ni reverse-transcribed kwa cDNA kwa kutumia reverse transcriptase. Kisha sampuli mbili za DNA ya genomic au cDNA zimeandikwa na dyes tofauti za umeme (kawaida nyekundu na kijani). Sampuli za DNA za genomic zilizoandikwa zimeunganishwa kwa kiasi sawa, zimeongezwa kwenye chip cha microarray, na kuruhusiwa kuzalisha kwa matangazo ya ziada kwenye microarray.

Hybridization ya sampuli genomic DNA molekuli inaweza kufuatiliwa kwa kupima kiwango cha fluorescence katika maeneo fulani juu ya microarray. Tofauti katika kiasi cha mahuluti kati ya sampuli zinaweza kuzingatiwa kwa urahisi. Ikiwa asidi ya nucleic moja tu ya sampuli huchanganya kwa doa fulani kwenye microarray, basi doa hiyo itaonekana ama kijani au nyekundu. Hata hivyo, kama asidi za nucleic za sampuli zote zinazalisha, basi doa itaonekana njano kutokana na mchanganyiko wa rangi nyekundu na kijani.

Ingawa microarray teknolojia inaruhusu kwa kulinganisha jumla kati ya sampuli mbili katika muda mfupi, inahitaji kisasa (na gharama kubwa) kugundua vifaa na uchambuzi programu. Kwa sababu ya gharama, teknolojia hii ni kawaida mdogo kwa mipangilio ya utafiti. Watafiti wametumia uchambuzi wa microarray kujifunza jinsi usemi wa jeni unavyoathiriwa katika viumbe vinavyoambukizwa na bakteria au virusi au wanakabiliwa na matibabu fulani ya kemikali.

Kielelezo\(\PageIndex{5}\): (a) Hatua za uchambuzi wa microarray zinaonyeshwa. Hapa, mifumo ya kujieleza jeni hulinganishwa kati ya seli za saratani na seli zenye afya. (b) Maelezo ya Microarray yanaweza kuelezwa kama ramani ya joto. Jeni huonyeshwa upande wa kushoto; sampuli tofauti huonyeshwa kote chini. Jeni zilizoonyeshwa tu katika seli za saratani zinaonyeshwa katika vivuli tofauti vya rangi nyekundu; jeni zilizoonyeshwa tu katika seli za kawaida zinaonyeshwa katika vivuli tofauti vya kijani. Jeni zinazoonyeshwa katika seli zote za saratani na za kawaida zinaonyeshwa kwa manjano.

Unganisha na Kujifunza

Kuchunguza microchip teknolojia katika tovuti hii maingiliano.

Zoezi\(\PageIndex{2}\)

1. Probe ya DNA inajumuisha nini?
2. Kwa nini blot ya Kusini hutumiwa baada ya electrophoresis ya gel ya DNA digest?

Uchambuzi Masi ya Protini

Mara nyingi huenda isiwe na kuhitajika au inawezekana kujifunza DNA au RNA moja kwa moja. Protini zinaweza kutoa taarifa maalum za aina kwa ajili ya utambulisho pamoja na taarifa muhimu kuhusu jinsi na kama seli au tishu inashughulikia kuwepo kwa microorganism ya pathogenic. Protini mbalimbali zinahitaji mbinu tofauti za kutengwa na sifa.

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Tofauti ya electrophoresis ya gel, inayoitwa polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), hutumiwa kwa kutenganisha protini. Katika PAGE, tumbo la gel ni nzuri na linajumuisha polyacrylamide badala ya agarose. Zaidi ya hayo, PAGE hufanyika kwa kutumia vifaa vya gel wima (Kielelezo\(\PageIndex{6}\)). Kwa sababu ya mashtaka tofauti yanayohusiana na minyororo ya upande wa amino asidi, PAGE inaweza kutumika kutenganisha protini intact kulingana na mashtaka yao wavu. Vinginevyo, protini zinaweza kubadilishwa na kuvikwa na sabuni ya kushtakiwa vibaya inayoitwa sodium dodecyl sulfate (SDS), masking mashtaka ya asili na kuruhusu kujitenga kulingana na ukubwa tu. PAGE inaweza kubadilishwa zaidi ili kutenganisha protini kulingana na sifa mbili, kama vile mashtaka yao katika PHs mbalimbali pamoja na ukubwa wao, kupitia matumizi ya PAGE mbili-dimensional. Katika mojawapo ya matukio haya, kufuatia electrophoresis, protini zinaonekana kwa njia ya uchafu, kwa kawaida na bluu ya Coomassie au stain ya fedha.

Kielelezo\(\PageIndex{6}\): (a) SDS ni sabuni ambayo inaathiri protini na masks mashtaka yao ya asili, na kuwafanya kwa usawa kushtakiwa vibaya. (b) Mchakato wa SDS-PAGE unaonyeshwa katika hatua hizi. (c) Picha ya gel ya SDS-PAGE inaonyesha bendi za Coomassie ambazo protini za ukubwa tofauti zimehamia pamoja na gel kwa kukabiliana na voltage iliyotumiwa. Mstari wa kawaida wa kawaida unaonekana upande wa kulia wa gel. (mikopo b: mabadiliko ya kazi na “GeneED” /YouTube)

Zoezi\(\PageIndex{3}\)

Kwa msingi gani protini zinajitenga katika SDS-PAGE?

Mwelekeo wa kliniki: Sehemu ya 3

Wakati Kayla alielezea dalili zake, daktari wake mwanzoni alishutumu meningitis ya bakteria, ambayo inafanana na maumivu ya kichwa na shingo ngumu. Hata hivyo, hivi karibuni alitawala jambo hili kama uwezekano kwa sababu meningitis kawaida inaendelea haraka zaidi kuliko kile Kayla alikuwa akipata. Dalili zake nyingi bado zinalingana na zile za sclerosis ya amyotrophic lateral (ALS) na lupus erythematosus ya utaratibu (SLE), na daktari pia alichukulia ugonjwa wa Lyme uwezekano kutokana na muda gani Kayla anatumia katika misitu. Kayla hakukumbuka kuumwa kwa hivi karibuni (njia ya kawaida ambayo ugonjwa wa Lyme hupitishwa) na hakuwa na upele wa kawaida wa jicho la ng'ombe unaohusishwa na ugonjwa wa Lyme (Kielelezo\(\PageIndex{7}\)). Hata hivyo, 20— 30% ya wagonjwa wenye ugonjwa wa Lyme hawajaendeleza upele huu, hivyo daktari hakutaka kuiondoa.

Daktari wa Kayla aliagiza MRI ya ubongo wake, hesabu kamili ya damu ili kupima upungufu wa damu, vipimo vya damu vinavyotathmini kazi ya ini na figo, na vipimo vya ziada vya kuthibitisha au kutawala ugonjwa wa SLE au Lyme. Matokeo yake ya mtihani yalikuwa haiendani na wote SLE na ALS, na matokeo ya mtihani kutafuta kingamwili za ugonjwa wa Lyme ilikuwa “babaishi,” maana yake inconclusive. Baada ya kuondokana na ALS na SLE, daktari wa Kayla aliamua kukimbia vipimo vya ziada vya ugonjwa wa Lyme.

Zoezi\(\PageIndex{4}\)

1. Kwa nini daktari wa Kayla bado anashutumu ugonjwa wa Lyme hata kama matokeo ya mtihani hayakugundua kingamwili za Lyme katika damu?
2. Ni aina gani ya mtihani Masi inaweza kutumika kwa ajili ya kugundua kingamwili damu kwa ugonjwa Lyme?

Kielelezo\(\PageIndex{7}\): Upele wa jicho la ng'ombe ni moja ya dalili za kawaida za magonjwa ya Lyme, lakini hadi asilimia 30 ya watu walioambukizwa hawajawahi kuendeleza upele. (mikopo: Vituo vya Kudhibiti Magonjwa na Kuzuia)

Mbinu za Uchambuzi wa DNA za Kupanua

Mbinu mbalimbali zinaweza kutumika kwa kupata utaratibu wa DNA, ambazo ni muhimu kwa kusoma viumbe vinavyosababisha magonjwa. Pamoja na ujio wa teknolojia ya haraka ya sequencing, msingi wetu wa ujuzi wa genomes nzima ya viumbe vya pathogenic imeongezeka kwa kiasi kikubwa. Tunaanza na maelezo ya mmenyuko wa mnyororo wa polymerase, ambayo si njia ya mpangilio lakini imeruhusu watafiti na madaktari kupata kiasi kikubwa cha DNA zinazohitajika kwa ajili ya mpangilio na masomo mengine. Mmenyuko wa mnyororo wa polymerase hupunguza utegemezi tuliowahi kuwa nayo kwenye seli ili kufanya nakala nyingi za DNA, kufikia matokeo sawa kwa njia ya athari rahisi nje ya seli.

Mmenyuko wa mnyororo wa Polymerase (PCR)

Mbinu nyingi za uchambuzi wa DNA, kama vile digestion ya kizuizi cha enzyme na electrophoresis ya gel ya agarose, au mpangilio wa DNA zinahitaji kiasi kikubwa cha kipande maalum cha DNA. Katika siku za nyuma, kiasi kikubwa cha DNA kilizalishwa kwa kukua seli za mwenyeji wa maktaba ya genomic. Hata hivyo, maktaba huchukua muda na jitihada za kuandaa na sampuli za DNA za riba mara nyingi huja kwa kiasi cha dakika. Mmenyuko wa mnyororo wa polymerase (PCR) inaruhusu amplification haraka kwa idadi ya nakala za utaratibu maalum wa DNA kwa uchambuzi zaidi (Kielelezo\(\PageIndex{8}\)). Mojawapo ya mbinu zenye nguvu zaidi katika biolojia ya molekuli, PCR ilianzishwa mwaka 1983 na Kary Mullis wakati wa Cetus Corporation. PCR ina maombi maalum katika utafiti, kuchunguza maabara, na kliniki, ikiwa ni pamoja na:

• kuamua mlolongo wa nucleotides katika eneo maalum la DNA
• kukuza eneo lengo la DNA kwa cloning katika vector plasmid
• kutambua chanzo cha sampuli ya DNA iliyoachwa katika eneo la uhalifu
• kuchambua sampuli kuamua ubaba
• kulinganisha sampuli za DNA ya kale na viumbe vya kisasa
• kuamua kuwepo kwa vigumu kwa utamaduni, au unculturable, microorganisms katika binadamu au sampuli za mazingira

PCR ni mbinu ya maabara ya vitro ambayo inachukua faida ya mchakato wa asili wa replication DNA. Vimeng'enya vya DNA polymerase vilivyotumiwa katika PCR vinatokana na prokaryotes ya hyperthermophilic. Taq DNA polymerase, ambayo hutumiwa kwa kawaida katika PCR, imetokana na bakteria ya Thermus aquaticus iliyotengwa na chemchemi ya moto katika Hifadhi ya Taifa ya Yellowstone. Replication ya DNA inahitaji matumizi ya primers kwa ajili ya kuanzishwa kwa replication kuwa bure 3-hydroxyl vikundi inapatikana kwa kuongeza nyukleotidi na DNA polymerase. Hata hivyo, wakati primers linajumuisha RNA ni kawaida kutumika katika seli, primers DNA hutumiwa kwa PCR. Vipindi vya DNA vinapendelea kutokana na utulivu wao, na primers za DNA zilizo na utaratibu unaojulikana zinazolenga eneo maalum la DNA zinaweza kuunganishwa kibiashara. Hizi primers DNA ni functionally sawa na probes DNA kutumika kwa mbinu mbalimbali hybridization ilivyoelezwa mapema, kisheria kwa malengo maalum kutokana na mshikamano kati ya mlolongo lengo DNA na primer.

PCR hutokea juu ya mizunguko mingi, kila ina hatua tatu: denaturation, annealing, na ugani. Mashine inayoitwa cyclers ya mafuta hutumiwa kwa PCR; mashine hizi zinaweza kupangwa kwa mzunguko wa moja kwa moja kupitia joto linalohitajika kila hatua (Kielelezo 12.1). Kwanza, DNA template mbili-stranded zenye mlolongo lengo ni denatured katika takriban 95 °C Halijoto ya juu inahitajika kimwili (badala ya enzymatically) kutenganisha kuachwa DNA ni sababu imara joto DNA polymerase inahitajika. Kisha, joto hupungua hadi takriban 50 °C Hii inaruhusu primers ya DNA inayoongezea mwisho wa mlolongo wa lengo kwa anneal (fimbo) kwa kuachwa template, na primer moja annealing kwa kila strand. Hatimaye, halijoto hufufuliwa hadi 72 °C, halijoto mojawapo kwa shughuli ya polimerasi ya DNA imara ya joto, kuruhusu kuongeza nyukleotidi kwa primer kwa kutumia shabaha moja-stranded kama template. Kila mzunguko mara mbili idadi ya nakala mbili-stranded lengo DNA. Kwa kawaida, itifaki za PCR zinajumuisha mzunguko wa 25—40, kuruhusu kuimarisha mlolongo mmoja wa lengo na mamilioni hadi zaidi ya trilioni.

Replication ya DNA ya asili imeundwa kunakili jenomu nzima, na huanzisha katika tovuti moja au zaidi ya asili. Primers hujengwa wakati wa kuiga, sio kabla, na haujumuishi utaratibu maalum. PCR inalenga mikoa maalum ya sampuli ya DNA kwa kutumia primers maalum ya mlolongo. Katika miaka ya hivi karibuni, mbinu mbalimbali za kuimarisha PCR isothermal ambazo zinazuia haja ya baiskeli ya mafuta zimeandaliwa, kwa kutumia faida ya protini za nyongeza ambazo zinasaidia katika mchakato wa kuiga DNA. Kama maendeleo ya mbinu hizi inaendelea na matumizi yao inakuwa zaidi kuenea katika utafiti, kuchunguza maabara, na kliniki, cyclers mafuta inaweza kuwa kizamani.

Kielelezo\(\PageIndex{8}\): mmenyuko wa mnyororo wa polymerase (PCR) hutumiwa kuzalisha nakala nyingi za mlolongo maalum wa DNA.

Unganisha na Kujifunza

Kuimarisha ufahamu wako wa mmenyuko wa mnyororo wa polymerase kwa kutazama uhuishaji huu na kufanya kazi kupitia zoezi la maingiliano.

Tofauti za PCR

Marekebisho kadhaa ya baadaye kwa PCR yanaongeza zaidi matumizi ya mbinu hii. Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) hutumiwa kupata nakala za DNA za molekuli maalum ya mRNA. RT-PCR huanza na matumizi ya enzyme reverse transcriptase kubadilisha molekuli mRNA katika cDNA. Hiyo cDNA ni kisha kutumika kama template kwa jadi PCR amplification. RT-PCR inaweza kuchunguza kama jeni maalum imeelezwa katika sampuli. Maombi mengine ya hivi karibuni ya PCR ni muda halisi PCR, pia inajulikana kama PCR upimaji (QPCR). Standard PCR na RT-PCR itifaki si upimaji kwa sababu yoyote moja ya vitendanishi inaweza kuwa kikwazo kabla ya yote ya mzunguko ndani ya itifaki ni kamili, na sampuli ni tu kuchambuliwa mwishoni. Kwa sababu haiwezekani kuamua wakati katika itifaki ya PCR au RT-PCR reagent iliyotolewa imekuwa kikwazo, haiwezekani kujua jinsi mzunguko wengi kukamilika kabla ya hatua hii, na hivyo haiwezekani kuamua jinsi wengi molekuli template awali walikuwa sasa katika sampuli mwanzoni mwa PCR. Katika QPCR, hata hivyo, matumizi ya fluorescence inaruhusu mtu kufuatilia ongezeko la template mara mbili-stranded wakati PCR mmenyuko kama hutokea. Hizi data kinetics kisha inaweza kutumika kupima kiasi cha mlolongo awali lengo. Matumizi ya QPCR katika miaka ya hivi karibuni yamepanua zaidi uwezo wa PCR, kuruhusu watafiti kuamua idadi ya nakala za DNA, na wakati mwingine viumbe, vilivyopo katika sampuli. Katika mazingira ya kliniki, QRT-PCR hutumiwa kuamua mzigo wa virusi katika wagonjwa wenye VVU ili kutathmini ufanisi wa tiba yao.

Mlolongo wa DNA

Mbinu ya msingi ya mpangilio ni mbinu ya kusitisha mnyororo, pia inajulikana kama njia ya dideoxy au njia ya mpangilio wa Sanger DNA, iliyoandaliwa na Frederick Sanger mwaka 1972. Njia ya kusitisha mnyororo inahusisha kuiga DNA ya template moja iliyopigwa na matumizi ya primer ya DNA ili kuanzisha awali ya kamba ya ziada, DNA polymerase, mchanganyiko wa monoma nne za kawaida za deoxynucleotide (DnTP), na sehemu ndogo ya dideoxynucleotides (DDNTP), kila kinachoitwa na molekuli beacon. DDNTPs ni monoma kukosa kundi la hidroxyl (-OH) kwenye tovuti ambayo nucleotide nyingine huunganisha kuunda mnyororo (Kielelezo\(\PageIndex{9}\)). Kila wakati DDNTP inaingizwa kwa nasibu katika strand inayoongezeka ya ziada, inakomesha mchakato wa replication ya DNA kwa kamba hiyo. Hii inasababisha vipande vingi vifupi vya DNA iliyoigwa ambayo kila mmoja imekamilika kwa hatua tofauti wakati wa kuiga. Wakati mchanganyiko wa mmenyuko unakabiliwa na electrophoresis ya gel, vipande vingi vya DNA vilivyoandikwa hivi karibuni vinaunda ngazi ya ukubwa tofauti. Kwa sababu DDNTPs zimeandikwa, kila bendi kwenye gel huonyesha ukubwa wa kamba ya DNA wakati DDNTP imekamilisha majibu.

Katika siku ya Sanger, athari nne zilianzishwa kwa kila molekuli ya DNA kuwa mpangilio, kila mmenyuko una moja tu ya DDNTP nne zinazowezekana. Kila DDNTP iliandikwa na molekuli ya fosforasi ya mionzi. Bidhaa za athari nne ziliendeshwa kwa njia tofauti kwa upande kwa upande kwa gel ndefu, nyembamba za PAGE, na bendi za urefu tofauti ziligunduliwa na autoradiography. Leo, mchakato huu umekuwa rahisi na matumizi ya DDNTPs, kila kinachoitwa na rangi tofauti ya rangi ya fluorescent au fluorochrome (Kielelezo\(\PageIndex{10}\)), katika mmenyuko mmoja wa mlolongo iliyo na DDNTPs zote nne zinazowezekana kwa kila molekuli ya DNA inayowekwa (Kielelezo\(\PageIndex{11}\)). Hizi fluorochromes hugunduliwa na spectroscopy ya flu Kuamua rangi ya fluorescence ya kila bendi kama inapita na detector hutoa mlolongo wa nucleotide wa kamba ya template.

Kielelezo\(\PageIndex{9}\): Dideoxynucleotide ni sawa na muundo wa deoxynucleotide, lakini haipo kikundi cha 3hidroxyl (kilichoonyeshwa na sanduku la kivuli). Wakati dideoxynucleotide imeingizwa kwenye kamba ya DNA, awali ya DNA inacha.

Kielelezo\(\PageIndex{10}\): Njia ya kuondoa mnyororo wa dideoxy ya Frederick Sanger inaonyeshwa, kwa kutumia DDNTPs zilizowekwa na fluorochromes. Kutumia DDNTPs, mchanganyiko wa vipande vya DNA vya kila ukubwa iwezekanavyo, tofauti kwa urefu na nucleotide moja tu, inaweza kuzalishwa. DNA imetenganishwa kwa misingi ya ukubwa na kila bendi inaweza kugunduliwa na detector ya fluorescence.

Kielelezo\(\PageIndex{11}\): Mchoro huu unafupisha njia ya mpangilio wa Sanger kwa kutumia DDNTPs yenye alama ya fluorochrome na electrophoresis ya gel ya capillary.

Tangu mwaka 2005, mbinu za mpangilio wa automatiska zinazotumiwa na maabara huanguka chini ya mwavuli wa mpangilio wa kizazi kijacho, ambayo ni kundi la mbinu za kiotomatiki zinazotumiwa kwa mpangilio wa haraka wa DNA. Mbinu hizi zimebadilisha uwanja wa jenetiki za Masi kwa sababu sequencers za gharama nafuu zinaweza kuzalisha utaratibu wa mamia ya maelfu au mamilioni ya vipande vifupi (jozi 25 hadi 600 za msingi) kwa siku moja tu. Ingawa variants kadhaa ya teknolojia ya kizazi kijacho sequencing hufanywa na makampuni mbalimbali (kwa mfano, 454 Life Sciences 'pyrosequencing na Illumina Solexa teknolojia), wote kuruhusu mamilioni ya besi kuwa mpangilio haraka, na kufanya mpangilio wa genomes nzima rahisi, gharama nafuu, na mahali pa kawaida. Katika mlolongo 454 (pyrosequencing), kwa mfano, sampuli ya DNA imegawanyika katika vipande 400—600-bp moja-strand, iliyopita na kuongeza ya adapta DNA kwa ncha zote mbili za kila kipande. Kila kipande cha DNA ni kisha immobilized juu ya bead na kukuzwa na PCR, kwa kutumia primers iliyoundwa kwa anneal kwa adapta, kujenga bead zenye nakala nyingi za kipande hicho cha DNA. Kila bead ni kisha kuweka katika vizuri tofauti zenye enzymes sequencing. Kwa kisima, kila moja ya nucleotides nne huongezwa moja baada ya nyingine; wakati kila mmoja akiingizwa, pyrophosphate inatolewa kama byproduct ya upolimishaji, ikitoa flash ndogo ya mwanga ambayo imeandikwa na detector. Hii inatoa utaratibu wa nyukleotidi kuingizwa kama strand mpya ya DNA ni alifanya na ni mfano wa awali mlolongo. Watazamaji wa kizazi kijacho hutumia programu ya kisasa ili kupata mchakato mbaya wa kuweka vipande vyote kwa utaratibu. Kwa ujumla, teknolojia hizi zinaendelea kuendeleza haraka, kupunguza gharama za mpangilio na kuongeza upatikanaji wa data za mlolongo kutoka kwa viumbe mbalimbali haraka.

Kituo cha Taifa cha Bioteknolojia Habari nyumba sana kutumika maumbile mlolongo database aitwaye Genbankambapo watafiti amana habari za maumbile kwa matumizi ya umma Baada ya kuchapishwa kwa data mlolongo, watafiti kupakia kwa GenBank, kutoa watafiti wengine kupata taarifa. Ushirikiano inaruhusu watafiti kulinganisha wapya aligundua au haijulikani sampuli mlolongo habari na safu kubwa ya data mlolongo kwamba tayari ipo.

Unganisha na Kujifunza

Tazama uhuishaji kuhusu mlolongo wa 454 ili kuimarisha uelewa wako wa njia hii.

Kutumia NAAT Kutambua maambukizi ya C. difficile

Javier, mgonjwa mwenye umri wa miaka 80 mwenye historia ya ugonjwa wa moyo, hivi karibuni alirudi nyumbani kutoka hospitali baada ya kufanyiwa utaratibu wa angioplasty kuingiza stent ndani ya mishipa ya moyo. Ili kupunguza uwezekano wa maambukizi, Javier alitumiwa antibiotics ya wigo mpana wa intravenous wakati na muda mfupi baada ya utaratibu wake. Alitolewa siku nne baada ya utaratibu, lakini wiki moja baadaye, alianza kupata tumbo la tumbo kali na kuhara maji mara kadhaa kwa siku. Alipoteza hamu yake, akawa na maji machafu sana, na akajenga homa. Pia aliona damu katika kitanda chake. Mke wa Javier alimwita daktari, ambaye alimwagiza kumpeleka kwenye chumba cha dharura mara moja.

Wafanyakazi wa hospitali walikimbia vipimo kadhaa na kugundua kuwa viwango vya ubunifu wa figo vya Javier viliinuliwa ikilinganishwa na viwango vya damu yake, ikionyesha kuwa figo zake hazikufanya kazi vizuri. Dalili za Javier zilipendekeza maambukizi iwezekanavyo na Clostridium difficile, bakteria ambayo inakabiliwa na antibiotics nyingi. Hospitali ilikusanya na kukuza sampuli ya kiti ili kuangalia uzalishaji wa sumu A na B na C. difficile, lakini matokeo yalirudi hasi. Hata hivyo, matokeo mabaya hayakuwa ya kutosha kutawala maambukizi ya C. difficile kwa sababu culturing ya C. difficile na kugundua sumu yake tabia inaweza kuwa vigumu, hasa katika baadhi ya aina ya sampuli. Ili kuwa salama, waliendelea na mtihani wa uchunguzi wa asidi ya nucleic acid (NAAT). Hivi sasa NaATs ni kiwango cha dhahabu cha uchunguzi wa kliniki cha kuchunguza vifaa vya maumbile ya pathogen. Katika kesi ya Javier, QPCR ilitumiwa kutafuta encoding ya jeni C. difficile sumu B (TCDB). Wakati uchambuzi wa QPCR ulirudi chanya, daktari aliyehudhuria alihitimisha kuwa Javier alikuwa kweli wanaosumbuliwa na maambukizi ya C. difficile na mara moja kinachotakiwa antibiotic vancomycin, kutumiwa ndani ya vena. Antibiotic iliondoa maambukizi na Javier alifanya upya kamili.

Kwa sababu maambukizi na C. difficile yalikuwa yameenea katika jamii ya Javier, sampuli yake ilichambuliwa zaidi ili kuona kama aina maalum ya C. difficile inaweza kutambuliwa. Sampuli ya chombo cha Javier ilikuwa chini ya ribotyping na repetitive mlolongo makao PCR (rep-PCR) uchambuzi. Katika ribotyping, mlolongo mfupi wa DNA kati ya 16S rRNA na 23S rRNA jeni ni aliongeza na wanakabiliwa na kizuizi digestion (Kielelezo\(\PageIndex{12}\)). Mlolongo huu unatofautiana kati ya matatizo ya C. difficile, hivyo enzymes ya kizuizi itakatwa katika maeneo tofauti Katika rep-PCR, primers DNA iliyoundwa kumfunga kwa utaratibu mfupi kawaida kupatikana mara kwa mara ndani ya C. difficile genome walikuwa kutumika kwa PCR. Kufuatia digestion kizuizi, agarose gel electrophoresis ilifanyika katika aina zote mbili za uchambuzi kuchunguza mifumo ya banding ambayo ilisababisha kila utaratibu (Kielelezo\(\PageIndex{13}\)). Rep-PCR inaweza kutumika kwa subtype zaidi ribotypes mbalimbali, kuongeza azimio la kuchunguza tofauti kati ya matatizo. Ribotype ya aina inayoambukiza Javier ilipatikana kuwa ribotype 27, aina inayojulikana kwa kuongezeka kwa virulence yake, upinzani dhidi ya antibiotics, na kuongezeka kwa maambukizi nchini Marekani, Canada, Japan, na Ulaya. ¹

Zoezi\(\PageIndex{5}\)

1. Je, mifumo ya banding inatofautiana kati ya matatizo ya C. difficile?
2. Kwa nini unafikiri vipimo vya maabara havikuweza kuchunguza uzalishaji wa sumu moja kwa moja?

Kielelezo\(\PageIndex{12}\): Gel inayoonyesha bidhaa za PCR za aina mbalimbali za Clostridium difficile. Sampuli ya Javier imeonyeshwa chini; kumbuka kuwa inafanana na ribotype 27 katika kuweka kumbukumbu. (mikopo: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia)

Kielelezo\(\PageIndex{13}\): Matatizo ya bakteria ya kuambukiza, kama vile C. difficile, yanaweza kutambuliwa na uchambuzi wa Masi. PCR ribotyping ni kawaida kutumika kutambua hasa C. matatizo difficile. REP-PCR ni mbinu mbadala ya Masi ambayo pia hutumiwa kutambua matatizo fulani ya C. difficile. (mikopo b: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani kwa Microbiology)

Zoezi\(\PageIndex{6}\)

1. Je, PCR inafanana na mchakato wa replication ya DNA ya asili katika seli? Je, ni tofauti gani?
2. Linganisha RT-PCR na QPCR katika suala la madhumuni yao.
3. Katika mlolongo wa kusitisha mlolongo, ni jinsi gani utambulisho wa kila nucleotide katika mlolongo umeamua?

Dhana muhimu na Muhtasari

• Kupata jeni ya riba ndani ya sampuli inahitaji matumizi ya uchunguzi wa DNA moja iliyopigwa iliyoandikwa na beacon ya Masi (kawaida radioactivity au fluorescence) ambayo inaweza kuchanganywa na asidi nyongeza ya nucleic moja iliyopigwa katika sampuli.
• Agarose gel electrophoresis inaruhusu kujitenga kwa molekuli za DNA kulingana na ukubwa.
• Uzuiaji wa kipande cha urefu wa polymorphism (RFLP) uchambuzi inaruhusu taswira na electrophoresis ya agarose ya aina tofauti za mlolongo wa DNA unaosababishwa na tofauti katika maeneo ya kizuizi.
• Southern waa uchambuzi inaruhusu watafiti kupata fulani DNA mlolongo ndani ya sampuli ambapo kaskazini waa uchambuzi inaruhusu watafiti kuchunguza hasa mRNA mlolongo walionyesha katika sampuli.
• Teknolojia ya microarray ni mbinu ya uchanganyiko wa asidi ya nucleic ambayo inaruhusu uchunguzi wa maelfu mengi ya jeni kwa mara moja ili kupata tofauti katika jeni au mifumo ya kujieleza jeni kati ya sampuli mbili za DNA ya genomic au cDNA,
• Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) inaruhusu kutenganishwa kwa protini kwa ukubwa, hasa ikiwa mashtaka ya protini ya asili yanafungwa kupitia pretreatment na SDS.
• Mmenyuko wa mnyororo wa polymerase inaruhusu amplification ya haraka ya mlolongo maalum wa DNA. Tofauti ya PCR inaweza kutumika kuchunguza mRNA kujieleza (reverse transcriptase PCR) au kupima mlolongo fulani katika sampuli ya awali (wakati halisi PCR).
• Ingawa maendeleo ya Sanger DNA mlolongo ilikuwa mapinduzi, maendeleo katika kizazi kijacho mlolongo kuruhusu kwa haraka na gharama nafuu mlolongo wa genomes ya viumbe wengi, kuongeza kasi ya kiasi cha data mpya mlolongo.

maelezo ya chini

1. 1 Patrizia Spigaglia, Fabrizio Barbanti, Anna Maria Dionisi, na Paola Mastrantonio. “Clostridium difficile hutenga Sugu kwa Fluoroquinolones nchini Italia: Kuibuka kwa PCR Ribotype 018.” Journal ya Microbiolojia ya Hospitali 48 no. 8 (2010): 2892—2896.