12.1: Microbes na Zana za Uhandisi wa Maumbile

Malengo ya kujifunza

• Kutambua zana za genetics Masi kwamba ni inayotokana na microorganis
• Eleza mbinu zilizotumiwa kuunda molekuli za DNA za recombinant
• Eleza mbinu zilizotumiwa kuanzisha DNA katika seli za prokaryotic
• Orodha ya aina ya maktaba ya genomic na kuelezea matumizi yao
• Eleza mbinu zilizotumiwa kuanzisha DNA katika seli za eukaryotic

Mtazamo wa kliniki: Sehemu 1

Kayla, mhandisi wa umeme mwenye umri wa miaka 24 na shauku ya kukimbia, alihamia tu kutoka Arizona kwenda New Hampshire kuchukua kazi mpya. Mwishoni mwa wiki yake mbali, yeye anapenda kuchunguza mazingira yake mapya, kwenda kwa muda mrefu katika misitu ya pine. Mnamo Julai alitumia wiki kutembea kupitia milima. Mapema Agosti, Kayla aliendeleza homa ya chini, maumivu ya kichwa, na maumivu ya misuli kali, na alihisi amechoka kidogo. Sifikiri sana, alichukua ibuprofen ili kupambana na dalili zake na akaapa kupata mapumziko zaidi.

Zoezi\(\PageIndex{1}\)

Ni aina gani za hali ya matibabu inayoweza kuwajibika kwa dalili za Kayla?

Sayansi ya kutumia mifumo hai kuwafaidisha wanadamu inaitwa bioteknolojia. Kitaalam akizungumza, ufugaji wa mimea na wanyama kwa njia ya kilimo na mazoea ya kuzaliana ni aina ya bioteknolojia. Hata hivyo, kwa maana ya kisasa, tunahusisha bioteknolojia na mabadiliko ya moja kwa moja ya genetics ya kiumbe ili kufikia sifa zinazohitajika kupitia mchakato wa uhandisi wa maumbile. Uhandisi wa maumbile unahusisha matumizi ya teknolojia ya DNA ya recombinant, mchakato ambao mlolongo wa DNA hutumiwa katika vitro, hivyo kuunda molekuli za DNA za recombinant ambazo zina mchanganyiko mpya wa vifaa vya maumbile. DNA recombinant kisha kuletwa katika viumbe jeshi. Ikiwa DNA inayoanzishwa inatokana na spishi tofauti, kiumbe cha jeshi sasa kinachukuliwa kuwa transgenic.

Mfano mmoja wa microorganism ya transgenic ni matatizo ya bakteria ambayo hutoa insulini ya binadamu (Kielelezo\(\PageIndex{1}\)). Jeni la insulini kutoka kwa wanadamu liliingizwa kwenye plasmid. Hii recombinant DNA plasmid kisha kuingizwa katika bakteria. Matokeo yake, microbes hizi za transgenic zinaweza kuzalisha na kuzalisha insulini ya binadamu. Prokaryotes nyingi zina uwezo wa kupata DNA ya kigeni na kuingiza jeni za kazi katika jenomu zao wenyewe kwa njia ya “kuunganisha” na seli nyingine (conjugation), maambukizi ya virusi (transduction), na kuchukua DNA kutoka mazingira (mabadiliko). Kumbuka kwamba taratibu hizi ni mifano ya uhamisho wa jeni usio na usawa - uhamisho wa vifaa vya maumbile kati ya seli za kizazi kimoja.

Kielelezo\(\PageIndex{1}\): Recombinant DNA teknolojia ni recombination bandia ya DNA kutoka viumbe wawili. Katika mfano huu, jeni la insulini la binadamu linaingizwa kwenye plasmid ya bakteria. Hii plasmid recombinant kisha inaweza kutumika kubadilisha bakteria, ambayo kupata uwezo wa kuzalisha protini insulini.

Cloning ya Masi

Herbert Boyer na Stanley Cohen kwanza walionyesha mchakato kamili wa cloning Masi mwaka 1973 walipofanikiwa kupachisha jeni kutoka chura ya Afrika iliyopigwa (Xenopus laevis) kuwa plasmid ya bakteria ambayo ilianzishwa hapo ndani ya jeshi la bakteria Escherichia coli. Cloning ya molekuli ni seti ya mbinu zinazotumiwa kujenga DNA recombinant na kuiingiza katika kiumbe mwenyeji; inafanya matumizi ya zana kadhaa za Masi ambazo zinatokana na vijiumbe.

Enzymes ya kuzuia na Ligas

Katika teknolojia ya DNA ya recombinant, molekuli za DNA zinatumiwa kwa kutumia enzymes zinazotokea asili zinazotokana hasa na bakteria na virusi. Kuundwa kwa molekuli recombinant DNA inawezekana kutokana na matumizi ya endonucleases kizuizi asili (kizuizi Enzymes), enzymes bakteria zinazozalishwa kama utaratibu wa ulinzi wa kukata na kuharibu kigeni cytoplasmic DNA ambayo ni kawaida kutokana na maambukizi bacteriophage. Stewart Linn na Werner Arber waligundua enzymes kizuizi katika masomo yao ya 1960 ya jinsi E. coli mipaka bacteriophage kuiga juu ya maambukizi. Leo, tunatumia enzymes za kizuizi sana kwa kukata vipande vya DNA ambavyo vinaweza kugawanywa kwenye molekuli nyingine ya DNA ili kuunda molekuli za recombinant. Kila kizuizi enzyme kupunguzwa DNA katika tabia kutambua tovuti, maalum, kawaida palindromic, DNA mlolongo kawaida kati ya nne hadi sita msingi jozi katika urefu. Palindrome ni mlolongo wa herufi zinazosoma mbele sawa na nyuma. (Neno “ngazi” ni mfano wa palindrome.) Utaratibu wa DNA ya Palindromic yana Utaratibu huo wa msingi katika mwelekeo wa 5hadi 3kwenye kamba moja kama katika mwelekeo wa 5hadi 3kwenye kamba ya ziada. Enzyme kizuizi inatambua palindrome DNA na kupunguzwa kila uti wa mgongo katika nafasi sawa katika palindrome. Baadhi ya Enzymes kizuizi kukata kuzalisha molekuli ambayo overhangs ziada (ncha nata) wakati wengine kukata bila kuzalisha overhangs vile, badala ya kuzalisha mwisho mkweli (Kielelezo\(\PageIndex{2}\)).

Molekuli na mwisho wa fimbo za ziada zinaweza kuvuta kwa urahisi, au kuunda vifungo vya hidrojeni kati ya misingi ya ziada, kwa mwisho wao wa nata. Hatua ya annealing inaruhusu uharibifu wa overhangs moja-stranded. Hybridization inahusu kujiunga pamoja na vipande viwili vya ziada vya DNA. Mwisho wa mwisho unaweza pia kushikamana pamoja, lakini kwa ufanisi zaidi kuliko mwisho wa nata kutokana na ukosefu wa overhangs ya ziada inayowezesha mchakato. Katika hali yoyote, ligationby DNA ligase unaweza kisha kujiunga na mbili backbones sukari-phosphate ya DNA kupitia covalent bonding, na kufanya molekuli kuendelea mara mbili strand. Mnamo mwaka wa 1972, Paul Berg, mwanabiokemia wa Stanford, alikuwa wa kwanza kuzalisha molekuli ya DNA ya recombinant kwa kutumia mbinu hii, kuchanganya virusi vya tumbili SV40 na E. coli bacteriophage lambda ili kuunda mseto.

Kielelezo\(\PageIndex{2}\): (a) Katika tovuti hii ya enzyme ya kizuizi cha nucleotide sita, inayotambuliwa na enzyme Bam HI, taarifa kwamba mlolongo unasoma sawa katika mwelekeo wa 5hadi 3kwenye vipande vyote viwili. Hii inajulikana kama palindrome. Kukatwa kwa DNA kwa enzyme ya kizuizi kwenye maeneo (iliyoonyeshwa na mishale nyeusi) hutoa vipande vya DNA na na mwisho wa nata. Kipande kingine cha DNA kilichokatwa na enzyme kizuizi kimoja kinaweza kushikamana na mojawapo ya mwisho huu wa nata, kutengeneza molekuli ya DNA ya recombinant (b) Tovuti hii ya kutambua nne-nucleotide pia inaonyesha mlolongo wa palindromic. Kukatwa kwa DNA kwa enzyme ya kizuizi Hae III kwenye maeneo yaliyoonyeshwa hutoa vipande vya DNA na na mwisho usiofaa. kipande nyingine yoyote ya DNA mkweli inaweza ambatanisha na moja ya mwisho mkweli zinazozalishwa, kutengeneza recombinant DNA molekuli.

Plasmidi

Baada ya kizuizi digestion, jeni ya riba ni kawaida kuingizwa katika plasmids, vipande vidogo vya kawaida mviringo, mbili-stranded DNA kwamba kuiga kwa kujitegemea ya kromosomu bakteria (tazama Tabia ya kipekee ya seli Prokaryotic). Katika teknolojia ya DNA ya recombinant, plasmidi hutumiwa mara nyingi kama wadudu, molekuli za DNA zinazobeba vipande vya DNA kutoka kiumbe kimoja hadi kingine. Plasmids kutumika kama wadudu inaweza kuwa genetically engineered na watafiti na makampuni ya usambazaji wa kisayansi kuwa na mali maalumu, kama mfano kwa kawaida kutumika plasmid vector PUC19 (Kielelezo\(\PageIndex{3}\)). Baadhi ya wadudu wa plasmid huwa na jeni zinazopatia upinzani wa antibiotiki; jeni hizi za upinzani huruhusu watafiti kupata urahisi makoloni yaliyo na plasmid kwa kuipamba kwenye vyombo vya habari vyenye antibiotiki inayofanana. Antibiotic inaua seli zote za jeshi ambazo hazina bandari ya vector ya plasmid inayotaka, lakini wale walio na vector wanaweza kuishi na kukua.

Vectors plasmid kutumika kwa cloning kawaida kuwa na tovuti polylinker, au nyingi cloning tovuti (MCS). Tovuti ya polylinker ni mlolongo mfupi ulio na maeneo mengi ya kipekee ya kizuizi ya kutambua enzyme ambayo hutumiwa kwa kuingiza DNA ndani ya plasmid baada ya mmeng'enyo wa kizuizi wa DNA na plasmid. Baada ya hizi nyingi kizuizi enzyme kutambua maeneo ndani ya tovuti polylinker hufanya plasmid vector hodari, hivyo inaweza kutumika kwa ajili ya majaribio mbalimbali cloning kuwashirikisha Enzymes mbalimbali kizuizi.

Tovuti hii ya polylinker mara nyingi hupatikana ndani ya jeni la mwandishi, mlolongo mwingine wa jeni ulioandaliwa kwa bandia ndani ya plasmid ambayo inafunga protini ambayo inaruhusu taswira ya kuingizwa kwa DNA. Jeni la mwandishi huruhusu mtafiti kutofautisha seli za jeshi zilizo na plasmidi za recombinant na vipande vya DNA zilizopigwa kutoka kwenye seli za jeshi ambazo zina vector isiyo ya recombinant ya plasmid. Jeni la mwandishi la kawaida linalotumiwa katika vectors ya plasmid ni bakteria lacz gene encoding beta-galactosidase, enzyme ambayo kwa kawaida hudhoofisha lactose lakini pia inaweza kuharibu analog isiyo na rangi ya synthetic X-gal, na hivyo kuzalisha makoloni ya bluu kwenye vyombo vya habari vya X-gal. Jeni la mwandishi wa LaCZ imezimwa wakati DNA ya recombinant inapowekwa kwenye plasmid. Kwa sababu protini ya LaCz haijazalishwa wakati jeni imezimwa, X-gal haiharibiki na makoloni nyeupe huzalishwa, ambayo yanaweza kutengwa. Njia hii ya uchunguzi wa bluu-nyeupe inaelezwa baadaye na inavyoonekana kwenye Kielelezo\(\PageIndex{4}\). Mbali na vipengele hivi, baadhi ya plasmidi huja kabla ya kufyonzwa na kwa enzyme inayohusishwa na plasmid linearized ili kusaidia katika ligation baada ya kuingizwa kwa vipande vya DNA vya kigeni.

Kielelezo\(\PageIndex{3}\): PUC19 vector ya plasmid iliyojengwa kwa artificially ni kawaida kutumika kwa cloning DNA ya kigeni. Mishale inaonyesha maelekezo ambayo jeni huandikwa. Kumbuka tovuti ya polylinker, iliyo na maeneo mengi ya kipekee ya kutambua enzyme, iliyopatikana ndani ya jeni la mwandishi wa LaCZ. Pia angalia gene ya upinzani wa ampicillin (amp) iliyowekwa kwenye plasmid.

Cloning ya Masi kwa kutumia Mabadiliko

Utaratibu unaotumiwa kwa kawaida wa kuanzisha plasmidi ya uhandisi ndani ya seli ya bakteria ni mabadiliko, mchakato ambao bakteria huchukua DNA huru kutoka katika mazingira yao. Kwa asili, DNA ya bure kwa kawaida inatokana na seli nyingine za bakteria za lysed; katika maabara, DNA huru katika mfumo wa plasmidi recombinant huletwa kwa mazingira ya seli.

Baadhi ya bakteria, kama vile Bacillus spp., huwa na uwezo wa kawaida, maana yake ni uwezo wa kuchukua DNA ya kigeni. Hata hivyo, si bakteria zote zina uwezo wa kawaida. Katika hali nyingi, bakteria lazima zifanyike kwa ufanisi katika maabara kwa kuongeza upungufu wa membrane ya seli. Hii inaweza kupatikana kwa njia ya matibabu ya kemikali ambayo hupunguza mashtaka kwenye utando wa seli au kwa kuwasababishia bakteria kwenye uwanja wa umeme ambao hujenga pores microscopic katika utando wa seli. Njia hizi hutoa bakteria yenye uwezo wa kemikali au electrocompetent, kwa mtiririko huo.

Kufuatia itifaki ya mabadiliko, seli za bakteria hupandwa kwenye katikati ya antibiotiki ili kuzuia ukuaji wa seli nyingi za jeshi ambazo hazikubadilishwa na plasmid inayopinga upinzani wa antibiotiki. Mbinu inayoitwa bluu-nyeupe uchunguzi ni kisha kutumika kwa ajili ya laCz -encoding wadudu plasmid kama vile PUC19. Makoloni ya Bluu yana enzyme ya beta-galactosidase ya kazi kwa sababu jeni la LaCz haliingiliki, huku hakuna DNA ya kigeni iliyoingizwa kwenye tovuti ya polylinker. Makoloni haya kwa kawaida yanatokana na plasmid iliyopigwa, linearized inayojitokeza yenyewe. Hata hivyo, makoloni nyeupe hawana enzyme ya beta-galactosidase ya kazi, inayoonyesha kuingizwa kwa DNA ya kigeni ndani ya tovuti ya polylinker ya vector ya plasmid, hivyo kuharibu jeni la LaCz. Hivyo, makoloni nyeupe yanayotokana na uchunguzi huu wa bluu-nyeupe yana plasmidi yenye kuingiza na inaweza kuchunguzwa zaidi ili kuashiria DNA ya kigeni. Ili kuhakikisha DNA sahihi iliingizwa ndani ya plasmid, kuingiza DNA inaweza kisha kuwa sequenced.

Unganisha na Kujifunza

Tazama uhuishaji wa cloning ya Masi kutoka Kituo cha Kujifunza DNA.

Zoezi\(\PageIndex{2}\)

Katika uchunguzi wa bluu-nyeupe, koloni ya bluu ina maana gani na kwa nini ni bluu?

Cloning ya Masi Kutumia Conjugation au Transduction

Mchakato wa bakteria wa kuunganishwa (tazama Jinsi Prokaryotes ya Asexual Kufikia Utofauti wa maumbile) pia inaweza kutumiwa kwa cloning ya Masi. F plasmids, au plasmids ya uzazi, huhamishwa kati ya seli za bakteria kupitia mchakato wa kuunganishwa. DNA ya recombinant inaweza kuhamishwa kwa conjugation wakati seli za bakteria zenye recombinant F plasmid zinachanganywa na seli za bakteria sambamba zinazopoteza plasmid. F plasmidi husimba muundo wa uso unaoitwa F pilus inayowezesha kuwasiliana kati ya seli iliyo na plasmidi F na moja bila plasmid F. Juu ya kuwasiliana, daraja la cytoplasmic linaunda kati ya seli mbili na seli ya F-plasmid iliyo na plasmid inaiga plasmid yake, kuhamisha nakala ya plasmid ya recombinant F kwa seli ya mpokeaji. Mara baada ya kupokea recombinant F plasmid, kiini mpokeaji inaweza kuzalisha F yake mwenyewe pilus na kuwezesha uhamisho wa recombinant F plasmid kwa seli ya ziada. Matumizi ya kuunganishwa kuhamisha plasmidi F recombinant kwa seli mpokeaji ni njia nyingine bora ya kuanzisha molekuli recombinant DNA katika seli jeshi.

Vinginevyo, bacteriophages inaweza kutumika kuanzisha DNA recombinant katika seli jeshi bakteria kwa njia ya kudanganywa kwa mchakato transduction (tazama Jinsi Asexual Prokaryotes Kufikia Utofauti wa maumbile). Katika maabara, vipande vya DNA vya riba vinaweza kuunganishwa kuwa phagemidi, ambazo ni plasmidi zilizo na utaratibu wa phage ambao huwawezesha kuwekwa vifurushi katika bacteriophages. Seli za bakteria zinaweza kuambukizwa na bacteriophages hizi ili phagemids za recombinant ziweze kuletwa ndani ya seli za bakteria. Kulingana na aina ya phage, DNA recombinant inaweza kuunganishwa katika jeshi bakteria genome (lysogeny), au inaweza kuwepo kama plasmid katika cytoplasm ya jeshi.

Kielelezo\(\PageIndex{4}\): hatua zinazohusika katika cloning Masi kwa kutumia mabadiliko ya bakteria ni ilivyoainishwa katika flowchart hii graphic.

Zoezi\(\PageIndex{2}\)

1. Kazi ya awali ya enzyme ya kizuizi ni nini?
2. Ni michakato gani miwili inayotumiwa ili kupata DNA ya recombinant ndani ya kiini cha jeshi la bakteria?
3. Tofautisha matumizi ya jeni ya upinzani wa antibiotic na jeni la mwandishi katika vector ya plasmid.

Kujenga Maktaba ya Jenomiki

Cloning ya molekuli pia inaweza kutumika kuzalisha maktaba ya genomic. Maktaba ni nakala kamili (au karibu kamili) ya jenomu ya kiumbe iliyo na plasmidi ya DNA ya recombinant iliyojengwa kuwa clones ya kipekee ya bakteria. Kuwa na maktaba hiyo inaruhusu mtafiti kuunda kiasi kikubwa cha kila kipande kwa kukua jeshi la bakteria kwa kipande hicho. Vipande hivi vinaweza kutumika kuamua mlolongo wa DNA na kazi ya jeni yoyote iliyopo.

Njia moja ya kuzalisha maktaba ya genomic ni ligate kizuizi cha mtu binafsi enzyme-mwilini vipande genomic katika wadudu plasmid kata na enzyme moja kizuizi (Kielelezo\(\PageIndex{5}\)). Baada ya mabadiliko katika jeshi la bakteria, kila kiini cha bakteria kilichobadilishwa huchukua plasmid moja ya recombinant na inakua katika koloni la seli. Seli zote katika koloni hii ni clones zinazofanana na hubeba plasmid sawa ya recombinant. Maktaba yanayotokana ni mkusanyiko wa makoloni, ambayo kila mmoja ina kipande cha jenomu ya awali ya viumbe, ambayo ni kila tofauti na tofauti na inaweza kila mmoja kutumika kwa ajili ya utafiti zaidi. Hii inafanya uwezekano wa watafiti kuchunguza clones hizi tofauti ili kugundua moja iliyo na jeni la riba kutoka kwa genome ya awali ya viumbe.

Kielelezo\(\PageIndex{5}\): Kizazi cha maktaba ya genomic huwezesha ugunduzi wa kipande cha DNA cha genomic kilicho na jeni la riba. (mikopo “micrograph”: mabadiliko ya kazi na Taasisi za Taifa za Afya)

Kujenga maktaba ya genomic kwa kutumia vipande vikubwa vya DNA ya genomic, bacteriophage ya E. coli, kama vile lambda, inaweza kutumika kama mwenyeji (Kielelezo\(\PageIndex{6}\)). DNA ya genomic inaweza kuwa sheared au enzymatically mwilini na ligated katika vector kabla ya mwilini bacteriophage lambda DNA. Kisha, hizi recombinant phage DNA molekuli inaweza kuwa vifurushi katika chembe phage na kutumika kuambukiza seli E. coli jeshi kwenye sahani. Wakati wa maambukizi ndani ya kila kiini, kila phage recombinant itafanya nakala nyingi yenyewe na lyse lawn E. coli, kutengeneza plaque. Hivyo, kila plaque kutoka maktaba phage inawakilisha kipekee recombinant phage zenye tofauti genomic DNA fragment. Plaques inaweza kisha kupimwa zaidi kutafuta jeni ya riba. Faida moja ya kuzalisha maktaba kwa kutumia phages badala ya plasmidi ni kwamba chembe ya phage inashikilia kuingiza kubwa zaidi ya DNA ya kigeni ikilinganishwa na vector ya plasmid, hivyo kuhitaji idadi ndogo sana ya tamaduni kuwakilisha kikamilifu jenomu nzima ya viumbe awali.

Kielelezo\(\PageIndex{6}\): Recombinant phage DNA molekuli ni kufanywa na ligating mwilini chembe phage na kugawanyika genomic DNA molekuli Hizi recombinant phage DNA molekuli ni vifurushi katika chembe phage na kuruhusiwa kuambukiza lawn bakteria. Kila plaque inawakilisha kipekee recombinant DNA molekuli ambayo inaweza zaidi kuchunguzwa kwa jeni ya riba.

Kuzingatia jeni zilizoelezwa katika kiumbe au hata tishu, watafiti hujenga maktaba kwa kutumia RNA ya mjumbe wa viumbe (mRNA) badala ya DNA yake ya genomic. Wakati seli zote katika kiumbe kimoja zitakuwa na DNA sawa ya genomic, tishu tofauti zinaonyesha jeni tofauti, huzalisha mchango tofauti wa mRNA. Kwa mfano, DNA zote za kiini za binadamu zina jeni la insulini, lakini seli pekee katika kongosho zinaonyesha mRNA zinazoongoza uzalishaji wa insulini. Kwa sababu mRNA haiwezi kuunganishwa moja kwa moja, katika maabara mRNA lazima itumike kama template na enzyme reverse transcriptase ili kufanya DNA nyongeza (cDNA). Msaidizi kamili wa mRNA ya kiini inaweza kubadilishwa-transcribed katika molekuli cDNA, ambayo inaweza kutumika kama template kwa DNA polymerase kufanya nakala mbili stranded DNA; vipande hivi inaweza hatimaye ligated katika ama wadudu plasmid au bacteriophage kuzalisha maktaba cDNA. Faida ya maktaba ya cDNA ni kwamba ina DNA kutokana na jeni zilizoelezwa tu kwenye seli. Hii ina maana kwamba introni, Utaratibu wa kudhibiti kama vile mapromota, na DNA zisizopelekwa kutafsiriwa katika protini haziwakilishwa katika maktaba. Mtazamo wa utaratibu uliotafsiriwa unamaanisha kuwa maktaba haiwezi kutumika kujifunza mlolongo na muundo wa jenomu kwa ukamilifu wake. Ujenzi wa maktaba ya genomic ya cDNA inavyoonekana katika Kielelezo\(\PageIndex{7}\).

Kielelezo\(\PageIndex{7}\): Complementary DNA (cDNA) ni alifanya kutoka mRNA na retroviral enzyme reverse transcriptase, kubadilishwa katika nakala mbili stranded, na kuingizwa katika ama wadudu plasmid au bacteriophage, kuzalisha maktaba cDNA. (mikopo “micrograph”: mabadiliko ya kazi na Taasisi za Taifa za Afya)

Zoezi\(\PageIndex{3}\)

1. Majeshi ya maktaba ya genomic yanaelezwa nini?
2. cDNA ni nini?

Kuanzisha Molekuli Recombinant katika majeshi Eukaryotic

Matumizi ya majeshi ya bakteria kwa uhandisi wa maumbile yaliweka msingi wa teknolojia ya DNA ya recombinant; hata hivyo, watafiti pia wamekuwa na riba kubwa katika seli za eukaryotic za uhandisi, hasa zile za mimea na wanyama. Kuanzishwa kwa molekuli za DNA za recombinant katika majeshi ya eukaryotic huitwa transfection. Mimea ya maumbile, inayoitwa mimea ya transgenic, ina riba kubwa kwa madhumuni ya kilimo na dawa. Kiwanda cha kwanza cha transgenic kilichouzwa kibiashara kilikuwa nyanya ya Flavr Savr iliyocheleweshwa-kukomaa, ambayo ilikuja soko mwaka 1994. Mifugo yenye maumbile pia yamezalishwa kwa ufanisi, na kusababisha, kwa mfano, katika nguruwe wenye thamani ya lishe iliyoongezeka ¹ na mbuzi ambao hutoa bidhaa za dawa katika maziwa yao. ²

Electroporation

Ikilinganishwa na seli za bakteria, seli za eukaryotiki huwa na kuwa chini ya amenable kama majeshi kwa molekuli za DNA za recombinant. Kwa sababu eukaryotes ni kawaida wala uwezo wa kuchukua DNA kigeni wala uwezo wa kudumisha plasmids, transfection ya majeshi eukaryotic ni changamoto zaidi na inahitaji mbinu zaidi intrusive kwa ajili ya mafanikio. Njia moja inayotumiwa kwa ajili ya kuhamisha seli katika utamaduni wa seli inaitwa electroporation. Pulsa fupi ya umeme inasababisha malezi ya pores ya muda mfupi katika bilayers phospholipid ya seli kwa njia ambayo jeni inaweza kuletwa. Wakati huo huo, pigo la umeme huzalisha malipo mazuri ya muda mfupi upande mmoja wa mambo ya ndani ya seli na malipo hasi upande wa pili; tofauti ya malipo huchota molekuli za DNA zilizosababishwa vibaya ndani ya seli (Kielelezo\(\PageIndex{8}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{8}\): Electroporation ni mbinu moja ya maabara inayotumiwa kuanzisha DNA katika seli za eukaryotic.

Microinjection

Njia mbadala ya transfection inaitwa microinjection. Kwa sababu seli eukaryotic ni kawaida kubwa kuliko wale wa prokaryotes, vipande DNA wakati mwingine kuwa moja kwa moja injected katika cytoplasm kutumia micropipette kioo, kama inavyoonekana katika Kielelezo\(\PageIndex{9}\).

Kielelezo\(\PageIndex{9}\): Microinjection ni mbinu nyingine ya kuanzisha DNA katika seli za eukaryotic. Sindano ya microinjection iliyo na DNA ya recombinant ina uwezo wa kupenya utando wa seli na bahasha ya nyuklia.

Gene bunduki

Kubadilisha seli za mimea inaweza kuwa ngumu zaidi kuliko seli za wanyama kwa sababu ya kuta zao za seli zenye nene. Njia moja inahusisha kutibu seli za mimea na enzymes ili kuondoa kuta zao za seli, kuzalisha protoplasts. Kisha, bunduki ya jeni hutumiwa kupiga chembe za dhahabu au tungsten zilizofunikwa na molekuli za DNA za recombinant ndani ya protoplasts ya mmea kwa kasi ya juu. Vipengele vya protoplast vya mpokeaji vinaweza kupona na kutumika kuzalisha mimea mpya ya transgenic (Kielelezo\(\PageIndex{10}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{10}\): Nzito-chuma chembe coated na DNA recombinant ni risasi katika protoplasts kupanda kwa kutumia gene bunduki. Seli zinazobadilishwa zinaruhusiwa kupona na zinaweza kutumika kuzalisha mimea ya recombinant. (a) schematic ya bunduki gene. (b) Picha ya bunduki ya jeni. (mikopo a, b: mabadiliko ya kazi na JA O'Brien, SC Lummis)

Kuhamisha wadudu

Njia nyingine ya transfecting mimea inahusisha kuhamisha wadudu, plasmidi ambayo inaweza kusonga kati ya seli za bakteria na eukaryotiki. Tumor-inducing (T _i) plasmids inayotokana na bakteria Agrobacterium tumefaciens ni kawaida kutumika kama wadudu kuhamisha kwa ajili ya kuingiza jeni katika mimea (Kielelezo\(\PageIndex{11}\)). Kwa asili, T _i plasmids ya A. tumefaciens husababisha mimea kuendeleza tumors wakati wao ni kuhamishwa kutoka seli za bakteria kupanda seli. Watafiti wameweza kuendesha plasmidi hizi zinazotokea kwa kawaida ili kuondoa jeni zao zinazosababisha tumor na kuingiza vipande vya DNA vinavyohitajika. Kutokana na recombinant T _i plasmids inaweza kuhamishiwa katika genome ya mmea kupitia uhamisho wa asili wa T _i plasmids kutoka kwa bakteria hadi mwenyeji wa mmea. Mara moja ndani ya kiini cha jeshi la mmea, jeni la riba linaunganisha tena katika genome ya kiini cha mmea.

Kielelezo\(\PageIndex{11}\): T _i plasmid ya Agrobacterium tumefaciens ni vector muhimu kuhamisha kwa ajili ya matumizi ya jeni ya riba katika seli za mimea. Jeni la riba limeunganishwa ndani ya T _i plasmid, ambayo huletwa ndani ya seli za mimea. Jeni la riba kisha linaunganisha tena katika genome ya kiini cha mmea, kuruhusu uzalishaji wa mimea ya transgenic.

Virusi vectors

Vectors ya virusi pia inaweza kutumika kuhamisha seli za eukaryotic. Kwa kweli, njia hii mara nyingi hutumiwa katika tiba ya jeni (tazama Tiba ya Gene) kuanzisha jeni za afya kwa wagonjwa wa binadamu wanaosumbuliwa na magonjwa yanayotokana na mabadiliko ya maumbile. Jeni za virusi zinaweza kufutwa na kubadilishwa na jeni kutolewa kwa mgonjwa; ³ virusi kisha huathiri kiini cha jeshi na hutoa DNA ya kigeni ndani ya jenomu ya kiini kilicholengwa. Adenoviruses mara nyingi hutumiwa kwa kusudi hili kwa sababu zinaweza kukua hadi titer ya juu na zinaweza kuambukiza wote wasiogawanyika na kugawa seli za jeshi. Hata hivyo, matumizi ya vectors virusi kwa tiba ya jeni inaweza kusababisha baadhi ya hatari kwa wagonjwa, kama ilivyojadiliwa katika Gene Tiba.

Zoezi\(\PageIndex{4}\)

1. Ni njia gani zinazotumiwa kuanzisha vectors za DNA za recombinant ndani ya seli za wanyama?
2. Kulinganisha na kulinganisha vectors kuhamisha na vectors virusi.

Dhana muhimu na Muhtasari

• Biotekolojia ni sayansi ya kutumia mifumo ya maisha ili kufaidika wanadamu. Katika miaka ya hivi karibuni, uwezo wa kubadilisha moja kwa moja genome ya viumbe kupitia uhandisi wa maumbile imekuwa inawezekana kutokana na maendeleo katika teknolojia recombinant DNA, ambayo inaruhusu watafiti kujenga molekuli recombinant DNA na mchanganyiko mpya wa vifaa vya maumbile.
• Cloning ya molekuli inahusisha mbinu zinazotumiwa kujenga DNA recombinant na kuwezesha replication yao katika viumbe jeshi. Mbinu hizi ni pamoja na matumizi ya enzymes za kizuizi (kukata DNA za kigeni na wadudu wa plasmid), ligation (kuweka vipande vya DNA pamoja), na kuanzishwa kwa DNA recombinant ndani ya viumbe jeshi (mara nyingi bakteria).
• Uchunguzi wa bluu-nyeupe unaruhusu uteuzi wa transformants za bakteria ambazo zina plasmidi recombinant kwa kutumia fenotype ya jeni ya mwandishi ambayo imezimwa kwa kuingizwa kwa kipande cha DNA.
• Maktaba ya genomic yanaweza kufanywa kwa cloning vipande vya genomic kutoka kwa kiumbe kimoja hadi kwenye vectors ya plasmid au kwenye bacteriophage.
• Maktaba ya cDNA yanaweza kuzalishwa ili kuwakilisha molekuli za mRNA zilizoonyeshwa kwenye kiini kwa hatua fulani.
• Transfection ya majeshi eukaryotic inaweza kupatikana kupitia mbinu mbalimbali kwa kutumia electroporation, bunduki gene, microinjection, kuhamisha wadudu, na wadudu virusi.

maelezo ya chini

1. 1 Liangxue Lai, Jing X. Kang, Rongfeng Li, Jingdong Wang, William T. Witt, Hwan Yul Yong, Yanhong Hao et al. “Kizazi cha Nguruwe za Transgenic zilizopigwa matajiri katika asidi ya mafuta ya Omega-3.” Nature Bioteknolojia 24 namba 4 (2006): 435—436.
2. 2 Raylene Ramos Moura, Luciana Magalhães Melo, na Vicente José de Figueirêdo Freitas. “Uzalishaji wa protini za recombinant katika Maziwa ya Mbuzi za Transgenic na zisizo za Transgen Archives Brazil ya Biolojia na Teknolojia 54 no. 5 (2011): 927—938.
3. 3 William S.M. Dunia na Karoly Jino. “Vectors Adenovirus kwa Tiba ya Gene, Chanjo na Tiba ya Kansa ya Gene.” Tiba ya sasa ya Gene 13 no. 6 (2013): 421.