2.3: Vyombo vya Microscopy

Malengo ya kujifunza

• Tambua na kuelezea sehemu za darubini ya shamba mkali
• Tumia jumla ya ukuzaji kwa darubini ya kiwanja
• Eleza vipengele vya kutofautisha na matumizi ya kawaida kwa aina mbalimbali za hadubini za mwanga, microscopes za elektroni, na microscopes ya uchunguzi wa skanning

Waanzilishi wa mwanzo wa hadubini walifungua dirisha katika ulimwengu usioonekana wa microorganisms. Lakini hadubini iliendelea kuendelea katika karne zilizofuata. Mnamo mwaka wa 1830, Joseph Jackson Lister aliunda darubini ya kisasa ya kisasa. Karne ya 20 iliona maendeleo ya hadubini ambayo iliongeza mwanga usioonekana, kama vile hadubini ya fluorescence, ambayo inatumia chanzo cha mwanga wa ultraviolet, na hadubini ya elektroni, ambayo inatumia mihimili ya elektroni ya wavelength ya muda mfupi. Maendeleo haya yalisababisha maboresho makubwa katika ukuzaji, azimio, na kulinganisha. Kwa kulinganisha, microscopes kiasi rudimentary ya van Leeuwenhoek na watu wake wa kawaida walikuwa mbali chini ya nguvu kuliko hata hadubini ya msingi katika matumizi ya leo. Katika sehemu hii, sisi kuchunguza mbalimbali ya teknolojia ya kisasa microscopic na maombi ya kawaida kwa kila aina ya darubini.

Mwanga hadubini

Aina nyingi za microscopes huanguka chini ya kikundi cha microscopes za mwanga, ambazo hutumia mwanga kutazama picha. Mifano ya hadubini za mwanga ni pamoja na hadubini za Brightfield, hadubini za darkfield, hadubini za kulinganisha awamu-tofauti, microscopes tofauti za kuingiliwa, hadubini za fluorescence, microscopes laser skanning confocal, na hadubini mbili Aina hizi mbalimbali za microscopes za mwanga zinaweza kutumiwa kutimiza katika uchunguzi na utafiti.

Brightfield Microscopes

Darubini ya Brightfield, labda aina ya kawaida ya darubini, ni darubini ya kiwanja yenye lenses mbili au zaidi zinazozalisha picha ya giza kwenye background mkali. Baadhi ya hadubini brightfield ni monocular (kuwa eyepiece moja), ingawa wengi karibu zaidi microscopes Brightfield ni binocular (kuwa eyepieces mbili), kama moja inavyoonekana katika Kielelezo\(\PageIndex{1}\); katika hali yoyote, kila eyepiece ina lens iitwayo lens ocular. Lenses ya ocular kawaida hukuza picha mara 10 (10). Katika mwisho mwingine wa tube mwili ni seti ya lenses lengo juu ya pua kupokezana. Ukuaji wa lenses hizi lengo kawaida ni kati ya 4kwa 100, na ukuzaji kwa kila lens mteule juu ya casing chuma ya lens. Lenses ya ocular na lengo hufanya kazi pamoja ili kuunda picha iliyokuzwa. Ukuaji wa jumla ni bidhaa ya ukuzaji wa ocular mara ukuzaji wa lengo:

\[\text{ocular magnification} \times \text{objective magnification} \nonumber\]

Kwa mfano, kama Lens\(40 \times\) lengo ni kuchaguliwa na lens ocular ni\(10\times\), ukuzaji jumla itakuwa

\[(40×)(10×)=400× \nonumber\]

Kielelezo\(\PageIndex{1}\): Vipengele vya darubini ya kawaida ya shamba.

Vipengele vya darubini ya kawaida ya shamba.

Kipengee kinachotazamwa kinaitwa specimen. Specimen imewekwa kwenye slide ya kioo, ambayo ni kisha imefungwa mahali kwenye hatua (jukwaa) la darubini. Mara slide imefungwa, specimen kwenye slide imewekwa juu ya mwanga kwa kutumia vifungo vya hatua ya mitambo ya x-y. Vipande hivi vinasonga slide juu ya uso wa hatua, lakini usiinue au kupunguza hatua. Mara baada ya specimen inakabiliwa juu ya mwanga, nafasi ya hatua inaweza kuinuliwa au kupunguzwa ili kuzingatia picha. Knob ya kuzingatia coarse hutumiwa kwa harakati kubwa na lenses za lengo la 4na 10; Knob nzuri ya kulenga hutumiwa kwa harakati ndogo, hasa kwa lenses za 40au 100.

Wakati picha zinapotukuzwa, huwa dimmer kwa sababu kuna mwanga mdogo kwa eneo la kitengo cha picha. Picha zilizotukuzwa sana zinazozalishwa na microscopes, kwa hiyo, zinahitaji taa kali. Katika darubini ya shamba mkali, mwanga huu hutolewa na mwangaza, ambayo ni kawaida bulb ya juu-kiwango chini ya hatua. Mwanga kutoka kwa mwangaza hupita kupitia lens ya condenser (iko chini ya hatua), ambayo inalenga mionzi yote ya mwanga kwenye specimen ili kuongeza mwanga. Msimamo wa condenser unaweza kuboreshwa kwa kutumia kitovu cha kuzingatia condenser; mara moja umbali wa kutosha umeanzishwa, condenser haipaswi kuhamishwa kurekebisha mwangaza. Ikiwa viwango vya mwanga vya chini vinahitajika, kiasi cha mwanga kinachopiga specimen kinaweza kubadilishwa kwa urahisi kwa kufungua au kufunga diaphragm kati ya condenser na specimen. Katika hali nyingine, mwangaza pia unaweza kubadilishwa kwa kutumia rheostat, kubadili dimmer ambayo hudhibiti ukubwa wa mwanga.

Darubini la uwanja mkali hujenga picha kwa kuongoza mwanga kutoka kwa mwangaza kwenye specimen; mwanga huu unaambukizwa tofauti, kufyonzwa, kutafakari, au kukataliwa na miundo tofauti. Rangi tofauti zinaweza kuishi tofauti kama zinavyoingiliana na chromophores (rangi ambazo huchukua na kutafakari wavelengths fulani za nuru) katika sehemu za specimen. Mara nyingi, chromophores huongezwa kwa specimen kwa kutumia stains, ambayo husaidia kuongeza tofauti na azimio. Kwa ujumla, miundo katika specimen itaonekana nyeusi, kwa kiwango tofauti, kuliko background mkali, na kujenga picha kali kwa ukuzaji hadi 1000. Kukuza zaidi ingekuwa kujenga picha kubwa, lakini bila azimio kuongezeka. Hii inatuwezesha kuona vitu vidogo kama bakteria, ambavyo vinaonekana kwa karibu 400au hivyo, lakini si vitu vidogo kama vile virusi.

Kwa ukuzaji wa juu sana, azimio linaweza kuathiriwa wakati mwanga unapita kupitia kiasi kidogo cha hewa kati ya specimen na lens. Hii ni kutokana na tofauti kubwa kati ya fahirisi za refractive za hewa na kioo; hewa hutawanya mionzi ya mwanga kabla ya kulenga na lens. Ili kutatua tatizo hili, tone la mafuta linaweza kutumika kujaza nafasi kati ya specimen na lens ya kuzamishwa mafuta, lens maalum iliyoundwa kutumiwa na mafuta ya kuzamishwa. Kwa kuwa mafuta ina index ya refractive sawa na ile ya kioo, huongeza angle ya juu ambayo mwanga unaoacha specimen unaweza kugonga lens. Hii huongeza mwanga uliokusanywa na, kwa hiyo, azimio la picha (Kielelezo\(\PageIndex{2}\)). Mafuta mbalimbali yanaweza kutumika kwa aina tofauti za mwanga.

Kielelezo\(\PageIndex{2}\): (a) Lenses za kuzamishwa mafuta kama hii hutumiwa kuboresha azimio. (b) Kwa sababu mafuta ya kuzamishwa na kioo vina fahirisi sawa za refractive, kuna kiasi kidogo cha kukataa kabla ya mwanga kufikia lens. Bila mafuta ya kuzamishwa, mwanga hutawanya wakati unapita kupitia hewa juu ya slide, kuharibu azimio la picha hiyo.

Darubini matengenezo: Mazoea bora

Hata darubini yenye nguvu sana haiwezi kutoa picha za juu-azimio ikiwa haijasafishwa vizuri na kudumishwa. Kwa kuwa lenses ni makini iliyoundwa na viwandani kwa refract mwanga na kiwango cha juu cha usahihi, hata lens kidogo chafu au scratched itakuwa refract mwanga katika njia zisizotarajiwa, kuharibu picha ya specimen. Aidha, microscopes ni vyombo vyenye maridadi, na uangalizi mkubwa lazima uchukuliwe ili kuepuka sehemu na nyuso za kuharibu. Miongoni mwa mambo mengine, huduma nzuri ya darubini ni pamoja na yafuatayo:

• kusafisha lenses na karatasi ya lens
• si kuruhusu lenses kuwasiliana slide (kwa mfano, kwa haraka kubadilisha lengo)
• kulinda bulb (ikiwa kuna moja) kutoka kuvunjika
• si kusuuza lengo ndani ya slide
• si kutumia coarse kulenga Knob wakati wa kutumia 40au zaidi lengo lenses
• tu kutumia mafuta ya kuzamishwa na lengo maalumu mafuta, kwa kawaida lengo la 100
• kusafisha mafuta kutoka lenses kuzamishwa baada ya kutumia darubini
• kusafisha mafuta yoyote kwa ajali kuhamishwa kutoka lenses nyingine
• kufunika darubini au kuiweka katika baraza la mawaziri wakati si katika matumizi

Darkfield hadubini

Darkfield microscope ni darubini mkali shamba ambayo ina mabadiliko madogo lakini muhimu kwa condenser. Disk ndogo, opaque (karibu 1 cm ya kipenyo) imewekwa kati ya mwanga na lens ya condenser. Hii kuacha opaque mwanga, kama disk inaitwa, vitalu zaidi ya mwanga kutoka illuminator kama inapita kwa njia ya condenser juu ya njia yake ya Lens lengo, kuzalisha koni mashimo ya mwanga ambayo ni kulenga specimen. Mwanga pekee unaofikia lengo ni mwanga ambao umekataliwa au umejitokeza na miundo katika specimen. Picha inayosababisha kawaida inaonyesha vitu vyenye mkali kwenye background ya giza (Kielelezo\(\PageIndex{3}\))

Kielelezo\(\PageIndex{3}\): kuacha mwanga opaque kuingizwa katika darubini mkali shamba hutumiwa kuzalisha picha ya darkfield. Kuacha mwanga huzuia mwanga kusafiri moja kwa moja kutoka kwa mwanga hadi lens lengo, kuruhusu mwanga tu yalijitokeza au refracted mbali specimen kufikia jicho.

Kuacha mwanga wa opaque kuingizwa kwenye darubini ya shamba mkali hutumiwa kuzalisha picha ya shamba la giza. Kuacha mwanga huzuia mwanga kusafiri moja kwa moja kutoka kwa mwanga hadi lens lengo, kuruhusu mwanga tu yalijitokeza au refracted mbali specimen kufikia jicho.

Darkfield hadubini mara nyingi unaweza kujenga high-tofauti, high-azimio picha ya sampuli bila matumizi ya stains, ambayo ni muhimu hasa kwa kuangalia vielelezo kuishi ambayo inaweza kuuawa au vinginevyo kuathirika na stains. Kwa mfano, spirochetes nyembamba kama Treponema pallidum, wakala causative ya kaswisi, inaweza kutazamwa vizuri kwa kutumia darkfield darkfield darkfield (Kielelezo\(\PageIndex{4}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{4}\): Matumizi ya darkfield darkfield inatuwezesha kuona hai, sampuli zisizohifadhiwa za spirochete Treponema pallidum. Sawa na hasi ya picha, spirochetes huonekana mkali dhidi ya historia ya giza. (mikopo: Vituo vya Kudhibiti Magonjwa na Kuzuia)

Matumizi ya darkfield darkfield darkfield inatuwezesha kuona hai, sampuli zisizohifadhiwa za spirochete Treponema pallidum. Sawa na hasi ya picha, spirochetes huonekana mkali dhidi ya historia ya giza. (mikopo: Vituo vya Kudhibiti Magonjwa na Kuzuia/C.W Hubbard)

Zoezi\(\PageIndex{1}\)

Tambua tofauti muhimu kati ya hadubini ya brightfield na darkfield.

Mwelekeo wa kliniki: Sehemu ya 2

Maambukizi ya majeraha kama Cindy's yanaweza kusababishwa na aina nyingi za bakteria, ambazo baadhi yake yanaweza kuenea haraka na matatizo makubwa. Kutambua sababu maalum ni muhimu sana kuchagua dawa ambayo inaweza kuua au kuacha ukuaji wa bakteria.

Baada ya kumwita daktari wa eneo kuhusu kesi ya Cindy, muuguzi wa kambi hutuma sampuli kutoka jeraha kwenye maabara ya karibu ya matibabu. Kwa bahati mbaya, tangu kambi iko katika eneo la mbali, maabara ya karibu ni ndogo na hayana vifaa. Maabara ya kisasa zaidi yanaweza kutumia mbinu nyingine kwa utamaduni, kukua, na kutambua bakteria, lakini katika kesi hii, fundi anaamua kufanya mlima wa mvua kutoka kwenye specimen na kuiona chini ya darubini ya brightfield. Katika mlima wa mvua, tone ndogo la maji linaongezwa kwenye slide, na kuingizwa kwa kifuniko kunawekwa juu ya specimen ili kuiweka mahali kabla ya kuwekwa chini ya lens ya lengo.

Chini ya darubini Brightfield, fundi anaweza vigumu kuona seli bakteria kwa sababu wao ni karibu uwazi dhidi ya background mkali. Ili kuongeza tofauti, fundi huingiza kuacha mwanga wa opaque juu ya mwangaza. Picha inayosababisha darkfield inaonyesha wazi kwamba seli za bakteria ni spherical na makundi katika makundi, kama zabibu.

• Kwa nini ni muhimu kutambua sura na mifumo ya ukuaji wa seli katika specimen?
• Ni aina gani nyingine za hadubini zinaweza kutumika kwa ufanisi ili kuona specimen hii?

Microscopes ya Tofauti ya awamu

Microscopes tofauti ya awamu hutumia kukataa na kuingiliwa kwa sababu ya miundo katika specimen ili kuunda picha za juu-tofauti, za juu-azimio bila uchafu. Ni aina ya zamani zaidi na rahisi ya darubini inayounda picha kwa kubadilisha wavelengths ya mionzi ya mwanga inayopitia specimen. Ili kuunda njia za wavelength zilizobadilishwa, kuacha annular hutumiwa katika condenser. Kuacha annular hutoa koni ya mashimo ya nuru inayozingatia specimen kabla ya kufikia lens ya lengo. Lengo lina sahani ya awamu iliyo na pete ya awamu. Matokeo yake, mwanga unaosafiri moja kwa moja kutoka kwa mwangaza hupita kupitia pete ya awamu wakati mwanga ulikataa au unaonekana na specimen hupita kupitia sahani. Hii inasababisha mawimbi yanayosafiri kupitia pete kuwa karibu nusu moja ya wavelength nje ya awamu na wale wanaopitia sahani. Kwa sababu mawimbi yana kilele na mabwawa, wanaweza kuongeza pamoja (ikiwa katika awamu pamoja) au kufuta kila mmoja nje (ikiwa ni nje ya awamu). Wakati wavelengths haipo nje ya awamu, mabwawa ya wimbi yatafuta kilele cha wimbi, kinachoitwa kuingiliwa kwa uharibifu. Miundo ambayo inakataza mwanga kisha itaonekana giza dhidi ya background mkali wa mwanga usio na refracted tu. Kwa ujumla, miundo ambayo inatofautiana katika vipengele kama vile index refractive itatofautiana katika viwango vya giza (Kielelezo\(\PageIndex{5}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{5}\): Mchoro huu wa darubini ya kulinganisha awamu-inaonyesha tofauti za awamu kati ya mwanga kupita kwa njia ya kitu na background. Tofauti hizi zinazalishwa kwa kupitisha mionzi kupitia sehemu tofauti za sahani ya awamu. Mionzi ya mwanga imesimama katika ndege ya picha, huzalisha tofauti kutokana na kuingiliwa kwao.

Mchoro huu wa darubini ya kulinganisha awamu-inaonyesha tofauti za awamu kati ya mwanga unaopita kupitia kitu na background. Tofauti hizi zinazalishwa kwa kupitisha mionzi kupitia sehemu tofauti za sahani ya awamu. Mionzi ya mwanga imesimama katika ndege ya picha, huzalisha tofauti kutokana na kuingiliwa kwao.

Kwa sababu huongeza tofauti bila kuhitaji stains, hadubini ya tofauti ya awamu-mara nyingi hutumiwa kuchunguza vielelezo vya kuishi. Miundo fulani, kama vile organelles katika seli za eukaryotic na endospores katika seli za prokaryotic, zinaonekana vizuri na hadubini ya awamu-tofauti (Kielelezo\(\PageIndex{6}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{6}\): Takwimu hii inalinganisha picha ya shamba mkali (kushoto) na picha ya kulinganisha awamu (kulia) ya seli sawa za epithelial zisizo rahisi za squamous. Seli ziko katikati na chini ya haki ya kila picha (kipengee cha kawaida juu ya seli ni uchafu wa seli). Angalia kwamba seli zisizohifadhiwa katika picha ya mkali ni karibu asiyeonekana dhidi ya historia, wakati seli katika picha ya kulinganisha awamu huonekana kuangaza dhidi ya historia, akifunua maelezo zaidi.

Takwimu hii inalinganisha picha ya shamba mkali (kushoto) na picha ya kulinganisha awamu (kulia) ya seli sawa za epithelial zisizo rahisi za squamous. Seli ziko katikati na chini ya haki ya kila picha (kipengee cha kawaida juu ya seli ni uchafu wa seli). Angalia kwamba seli zisizohifadhiwa katika picha ya mkali ni karibu asiyeonekana dhidi ya historia, wakati seli katika picha ya kulinganisha awamu huonekana kuangaza dhidi ya historia, akifunua maelezo zaidi. (mikopo: “Wazi kefir” /Wikimedia Commons)

Tofauti kuingilia kati microscopes tofauti

hadubini tofauti za kuingilia kati (DIC) (pia inajulikana kama optics ya Nomarski) zinafanana na hadubini za kulinganisha awamu kwa kuwa zinatumia mifumo ya kuingiliwa ili kuongeza tofauti kati ya vipengele tofauti vya specimen. Katika darubini ya DIC, mihimili miwili ya mwanga huundwa ambayo mwelekeo wa harakati za wimbi (polarization) hutofautiana. Mara baada ya mihimili kupita kwa njia ya specimen au nafasi ya bure ya sampuli, wao ni recombined na madhara ya sampuli kusababisha tofauti katika mifumo ya kuingiliwa yanayotokana na kuchanganya ya mihimili. Hii inasababisha picha za juu za viumbe hai na kuonekana kwa tatu-dimensional. Microscopes hizi ni muhimu hasa katika kutofautisha miundo ndani ya vielelezo vya kuishi, visivyostainiwa. (Kielelezo\(\PageIndex{7}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{7}\): picha DIC ya Fonsecaea pedrosoi mzima juu ya agar iliyopita Leonian ya. Kuvu hii husababisha chromoblastomycosis, maambukizi ya ngozi ya muda mrefu ya kawaida katika hali ya hewa ya kitropiki na ya chini.

DIC picha ya Fonsecaea pedrosoi mzima juu ya agar iliyopita Leonian ya. Kuvu hii husababisha chromoblastomycosis, maambukizi ya ngozi ya muda mrefu ya kawaida katika hali ya hewa ya kitropiki na ya chini.

Zoezi\(\PageIndex{2}\)

Je! Ni faida gani za tofauti ya awamu-na hadubini ya DIC?

Fluorescence Microscopes

Microscope ya fluorescence hutumia chromophores ya fluorescent inayoitwa fluorochromes, ambayo ina uwezo wa kunyonya nishati kutoka chanzo cha mwanga na kisha kutoa nishati hii kama mwanga unaoonekana. Fluorochromes hujumuisha vitu vya kawaida vya fluorescent (kama vile chlorophylls) pamoja na stains za fluorescent ambazo zinaongezwa kwenye specimen ili kuunda tofauti Dyes kama vile Texas nyekundu na FITC ni mifano ya fluorochromes. Mifano mingine ni pamoja na dyes asidi nucleic 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) na acridine machungwa.

Darubini hupeleka mwanga wa uchochezi, kwa ujumla aina ya EMR yenye wavelength fupi, kama vile mwanga wa ultraviolet au bluu, kuelekea specimen; chromophores huchukua mwanga wa uchochezi na hutoa mwanga unaoonekana na wavelengths ndefu. Mwanga wa uchochezi huchujwa nje (kwa sehemu kwa sababu mwanga wa ultraviolet una hatari kwa macho) ili mwanga unaoonekana tu unapita kupitia lens ya ocular. Hii inazalisha picha ya specimen katika rangi nyekundu dhidi ya background ya giza.

Microscopes ya fluorescence ni muhimu hasa katika microbiolojia ya kliniki. Zinaweza kutumika kutambua vimelea, kupata spishi fulani ndani ya mazingira, au kupata maeneo ya molekuli na miundo fulani ndani ya seli. Mbinu pia zimeandaliwa ili kutofautisha wanaoishi kutoka kwa seli zilizokufa kwa kutumia hadubini ya fluorescence kulingana na kama huchukua fluorochromes fulani. Wakati mwingine, fluorochromes nyingi hutumiwa kwenye specimen sawa ili kuonyesha miundo tofauti au vipengele.

Moja ya maombi muhimu zaidi ya hadubini ya fluorescence ni mbinu inayoitwa immunofluorescence, ambayo hutumiwa kutambua microbes fulani zinazosababisha magonjwa kwa kuchunguza kama antibodies huwafunga. (Kingamwili ni molekuli za protini zinazozalishwa na mfumo wa kinga zinazoambatana na vimelea maalum ili kuziua au kuzizuia.) Kuna mbinu mbili za mbinu hii: mtihani wa moja kwa moja wa immunofluorescence (DFA) na mtihani wa immunofluorescence usio wa moja kwa moja (IFA). Katika DFA, antibodies maalum (kwa mfano, zile ambazo zina lengo la virusi vya kichwani) zinaharibiwa na fluorochrome. Ikiwa specimen ina pathogen inayotengwa, mtu anaweza kuchunguza antibodies inayofunga kwa pathogen chini ya darubini ya fluorescent. Hii inaitwa msingi antibody stain kwa sababu antibodies kubadilika ambatisha moja kwa moja na pathogen.

Katika IFA, antibodies ya sekondari husababishwa na fluorochrome badala ya antibodies ya msingi. Antibodies ya sekondari haziunganishi moja kwa moja na pathogen, lakini zinafunga kwa antibodies za msingi. Wakati antibodies ya msingi isiyokuwa imefungwa kwa pathogen, antibodies ya sekondari ya fluorescent inaweza kuzingatiwa kuwa imefungwa kwa antibodies ya msingi. Hivyo, antibodies ya sekondari ni masharti moja kwa moja kwa pathogen. Kwa kuwa antibodies nyingi za sekondari zinaweza kushikamana na antibody ya msingi, IFA huongeza idadi ya antibodies za fluorescent zilizounganishwa na specimen, na iwe rahisi kutazama vipengele katika specimen (Kielelezo\(\PageIndex{8}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{8}\): (a) Doa moja kwa moja ya immunofluorescent hutumiwa kutazama Neisseria gonorrhoeae, bakteria inayosababisha kisonono. (b) moja kwa moja immunofluorescent doa kutumika taswira mabuu ya Schistosoma mansoni, vimelea minyoo ambayo husababisha schistosomiasis, ugonjwa wa matumbo kawaida katika nchi za hari. (c) Katika immunofluorescence moja kwa moja, stain inachukuliwa na antibody ya msingi, ambayo hufunga kwa antigen. Katika immunofluorescence isiyo ya moja kwa moja, stain inachukuliwa na antibody ya sekondari, ambayo hufunga kwa antibody ya msingi, ambayo, kwa upande wake, hufunga kwa antigen. (mikopo a: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa; mikopo b: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa)

Zoezi\(\PageIndex{3}\)

Kwa nini fluorochromes lazima itumike kuchunguza specimen chini ya darubini ya fluorescence?

Microscopes Confocal

Ingawa aina nyingine za hadubini ya mwanga huunda picha ambayo inalenga kwa umbali mmoja kutoka kwa mwangalizi (kina, au z-ndege), darubini ya confocal inatumia laser kupima ndege nyingi za z mfululizo. Hii inazalisha picha nyingi za pande mbili, za juu-azimio katika kina kirefu, ambazo zinaweza kujengwa katika picha tatu-dimensional na kompyuta. Kama ilivyo na microscopes ya fluorescence, stains za fluorescent hutumiwa kuongeza tofauti na azimio. Image uwazi ni zaidi kuimarishwa na aperture nyembamba kwamba hupunguza mwanga wowote ambayo si kutoka z-ndege. Microscopes confocal ni hivyo muhimu sana kwa ajili ya kuchunguza sampuli nene kama vile biofilms, ambayo inaweza kuchunguzwa hai na unfixed (Kielelezo\(\PageIndex{9}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{9}\): Microscopy ya Confocal inaweza kutumika kutazama miundo kama vile biofilm hii ya paa ya cyanobacterium. (mikopo: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani kwa Microbiology).

Microscopes mbili za photon

Wakati microscopes ya awali ya umeme na ya confocal iliruhusu taswira bora ya vipengele vya kipekee katika vielelezo, bado kulikuwa na matatizo ambayo yalizuia taswira bora. Uelewa wa ufanisi wa hadubini ya fluorescence wakati wa kutazama vielelezo vidogo kwa ujumla ulikuwa mdogo na flare ya nje ya lengo, ambayo ilisababisha azimio duni. Upeo huu ulipunguzwa sana katika microscope ya confocal kupitia matumizi ya pinhole ya confocal kukataa nje ya focus background fluorescence na nyembamba (<1 μm), sehemu zisizo wazi za macho. Hata hivyo, hata microscopes za confocal zilikosa azimio linalohitajika kwa kutazama sampuli za tishu Matatizo haya yalitatuliwa na maendeleo ya darubini mbili za photon, ambayo inatumia mbinu ya skanning, fluorochromes, na mwanga wa muda mrefu wa wavelength (kama vile infrared) ili kutazama vielelezo. Nishati ya chini inayohusishwa na mwanga wa muda mrefu ina maana kwamba photoni mbili zinapaswa kugonga mahali wakati huo huo ili kusisimua fluorochrome. Nishati ya chini ya mwanga wa msisimko ni chini ya kuharibu seli, na wavelength ndefu ya mwanga wa msisimko huingia kwa urahisi ndani ya vielelezo vidogo. Hii inafanya darubini mbili-fotoni muhimu kwa kuchunguza seli hai ndani ya tishu intact- vipande vya ubongo, majusi, viungo vyote, na hata wanyama wote.

Hivi sasa, matumizi ya hadubini mbili za photon ni mdogo kwa maabara ya juu ya kliniki na utafiti kwa sababu ya gharama kubwa za vyombo. Darubini moja la photon mbili huwa na gharama kati ya $300,000 na $500,000, na lasers zinazotumiwa kusisimua rangi zinazotumiwa kwenye vielelezo pia ni ghali sana. Hata hivyo, kama teknolojia inaboresha, microscopes mbili za photon zinaweza kupatikana kwa urahisi zaidi katika mazingira ya kliniki.

Zoezi\(\PageIndex{4}\)

Ni aina gani za vielelezo vinavyozingatiwa vizuri kwa kutumia microscopy ya confocal au mbili-photon?

Electron hadubini

Azimio la juu la kinadharia la picha zilizoundwa na microscopes za mwanga ni hatimaye mdogo na wavelengths ya mwanga unaoonekana. Microscopes nyepesi nyingi zinaweza kukuza 1000tu, na wachache wanaweza kukuza hadi 1500, lakini hii haianza kukaribia nguvu ya kukuza ya darubini ya elektroni (EM), ambayo inatumia mihimili ya elektroni ya wavelength ya muda mfupi badala ya mwanga kuongeza ukuzaji na azimio.

Electroni, kama mionzi ya umeme, zinaweza kuishi kama mawimbi, lakini kwa wavelengths ya 0.005 nm, zinaweza kuzalisha azimio bora zaidi kuliko mwanga unaoonekana. EM inaweza kuzalisha picha kali ambayo inakuzwa hadi 100,000. Hivyo, EMs zinaweza kutatua miundo subcellular pamoja na baadhi ya miundo ya molekuli (kwa mfano, kuachwa moja ya DNA); hata hivyo, hadubini ya elektroni haiwezi kutumika kwenye nyenzo hai kwa sababu ya mbinu zinazohitajika kuandaa sampuli.

Kuna aina mbili za msingi za EM: microscope ya elektroni ya maambukizi (TEM) na microscope ya elektroni ya skanning (SEM) (Kielelezo\(\PageIndex{10}\)). TEM ni sawa na darubini ya mwanga mkali kwa njia ya jinsi inavyofanya kazi. Hata hivyo, inatumia boriti ya elektroni kutoka juu specimen ambayo inalenga kwa kutumia lens magnetic (badala ya lens kioo) na makadirio kupitia specimen kwenye detector. Electroni hupita kupitia specimen, na kisha detector inachukua picha (Kielelezo\(\PageIndex{11}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{10}\): (a) microscope ya elektroni ya maambukizi (TEM). (b) microscope ya elektroni ya skanning (SEM). (mikopo a: mabadiliko ya kazi na “Deshi” /Wikimedia Commons; mikopo b: mabadiliko ya kazi na “ZEISS Microscopy” /Flickr)

Kielelezo\(\PageIndex{11}\): Microscopes za elektroni hutumia sumaku kuzingatia mihimili ya elektroni sawa na njia ambayo hadubini za mwanga hutumia lenses kuzingatia mwanga.

Kwa elektroni kupita katika specimen katika TEM, specimen lazima iwe nyembamba sana (20-100 nm nene). Picha hiyo inazalishwa kwa sababu ya opacity tofauti katika sehemu mbalimbali za specimen. Opacity hii inaweza kuimarishwa kwa kudanganya specimen na vifaa kama vile metali nzito, ambayo ni elektroni mnene. TEM inahitaji kwamba boriti na specimen ziwe katika utupu na kwamba specimen iwe nyembamba sana na imeharibika. Hatua maalum zinazohitajika kuandaa specimen ya uchunguzi chini ya EM zinajadiliwa kwa undani katika sehemu inayofuata.

SEMs huunda picha za nyuso za vielelezo, kwa kawaida kutoka kwa elektroni ambazo zimefungwa na vielelezo na boriti ya elektroni. Hii inaweza kuunda picha za kina na kuonekana kwa tatu-dimensional ambazo zinaonyeshwa kwenye kufuatilia (Kielelezo\(\PageIndex{12}\)). Kwa kawaida, sampuli ni kavu na tayari na fixatives kwamba kupunguza mabaki, kama vile shriveling, ambayo inaweza kuzalishwa kwa kukausha, kabla ya kuwa sputter-coated na safu nyembamba ya chuma kama vile dhahabu. Ingawa maambukizi hadubini ya elektroni inahitaji sehemu nyembamba sana na inaruhusu mtu kuona miundo ya ndani kama vile organelles na mambo ya ndani ya utando, skanning hadubini ya elektroni inaweza kutumika kutazama nyuso za vitu vikubwa (kama vile nafaka ya poleni) pamoja na nyuso za sampuli ndogo sana ( Kielelezo\(\PageIndex{13}\)). Baadhi ya EMs zinaweza kukuza picha hadi 2,000,000. ¹

Kielelezo\(\PageIndex{12}\): Mifano hizi za kimapenzi hulinganisha vipengele vya microscopes ya elektroni ya maambukizi na microscopes za elektroni

Kielelezo\(\PageIndex{13}\): (a) Picha hii ya TEM ya seli katika biofilm inaonyesha miundo ya ndani ya seli kwa sababu ya viwango tofauti vya opacity katika specimen. (b) Picha hii ya SEM iliyoimarishwa na rangi ya bakteria Staphylococcus aureus inaonyesha uwezo wa skanning hadubini ya elektroni ili kutoa picha tatu-dimensional ya muundo wa uso wa seli. (mikopo a: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia; mikopo b: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa)

Zoezi\(\PageIndex{5}\)

1. Je! Ni faida gani na hasara za hadubini ya elektroni, kinyume na hadubini ya mwanga, kwa kuchunguza vipimo vya microbiological?
2. Ni aina gani za vielelezo vinavyozingatiwa vizuri kwa kutumia TEM? SEM?

Kutumia hadubini Kujifunza Biofilms

Biofilm ni jumuiya tata ya aina moja au zaidi ya microorganism, kwa kawaida kutengeneza kama mipako slimy masharti ya uso kwa sababu ya uzalishaji wa dutu extrapolymeric (EPS) kwamba inaona kwa uso au katika interface kati ya nyuso (kwa mfano, kati ya hewa na maji). Kwa asili, biofilms ni nyingi na mara nyingi huchukua niches tata ndani ya mazingira (Kielelezo\(\PageIndex{14}\)). Katika dawa, biofilms inaweza kuvaa vifaa vya matibabu na kuwepo ndani ya mwili. Kwa sababu wana sifa za kipekee, kama vile kuongezeka kwa upinzani dhidi ya mfumo wa kinga na dawa za antimicrobial, biofilms ni ya manufaa hasa kwa microbiologists na madaktari sawa.

Kwa sababu biofilms ni nene, haziwezi kuzingatiwa vizuri sana kwa kutumia hadubini nyepesi; slicing biofilm kujenga sampuli nyembamba inaweza kuua au kuvuruga jamii microbial. Confocal hadubini hutoa picha wazi ya biofilms kwa sababu inaweza kuzingatia z-ndege moja kwa wakati na kuzalisha picha tatu-dimensional ya specimen nene. Dyes ya fluorescent inaweza kusaidia katika kutambua seli ndani ya tumbo. Zaidi ya hayo, mbinu kama vile immunofluorescence na fluorescence katika situ hybridization (FISH), ambapo probes fluorescent hutumiwa kumfunga kwa DNA, inaweza kutumika.

Microscopy ya elektroni inaweza kutumika kuchunguza biofilms, lakini tu baada ya kuharibu specimen, ambayo hutoa mabaki yasiyofaa na inapotosha specimen. Mbali na mbinu hizi, inawezekana kufuata mikondo ya maji kupitia maumbo (kama vile mbegu na uyoga) ya biofilms, kwa kutumia video ya harakati za shanga za fluorescently (Kielelezo\(\PageIndex{15}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{14}\): Aina ya biofilm wakati bakteria ya planktonic (free-floating) ya aina moja au zaidi kuambatana na uso, kuzalisha lami, na kuunda koloni. (mikopo: Maktaba ya Umma ya Sayansi).

Kielelezo\(\PageIndex{15}\): Katika picha hii, aina nyingi za bakteria hukua katika biofilm juu ya chuma cha pua (iliyosababishwa na DAPI kwa miscroscopy epifluorescence). (mikopo: Ricardo Murga, Rodney Donlan).

Skanning Probe hadubini

Microscope ya uchunguzi wa skanning haitumii mwanga au elektroni, lakini badala ya probes kali sana ambazo hupitishwa juu ya uso wa specimen na kuingiliana nayo moja kwa moja. Hii inazalisha maelezo ambayo yanaweza kukusanyika katika picha na ukuzaji hadi 100,000,000. Ukuaji mkubwa huo unaweza kutumika kuchunguza atomi za mtu binafsi kwenye nyuso. Hadi sasa, mbinu hizi zimetumika hasa kwa ajili ya utafiti badala ya uchunguzi.

Kuna aina mbili za microscope ya skanning probe: darubini ya skanning tunneling (STM) na darubini ya nguvu ya atomiki (AFM). STM inatumia probe kwamba ni kupita tu juu ya specimen kama mara kwa mara voltage upendeleo inajenga uwezekano wa sasa umeme kati ya probe na specimen. Sasa hii hutokea kupitia tunneling quantum ya elektroni kati ya probe na specimen, na ukubwa wa sasa unategemea umbali kati ya probe na specimen. Probe inahamishwa kwa usawa juu ya uso na ukubwa wa sasa hupimwa. Skanning microscopy tunneling inaweza ufanisi ramani muundo wa nyuso katika azimio ambayo atomi ya mtu binafsi inaweza kuwa wanaona.

Sawa na STM, AFMs zina probe nyembamba ambayo hupitishwa tu juu ya specimen. Hata hivyo, badala ya kupima tofauti katika sasa kwa urefu wa mara kwa mara juu ya specimen, AFM huanzisha sasa ya mara kwa mara na kupima tofauti katika urefu wa ncha ya uchunguzi kama inapita juu ya specimen. Kama ncha ya uchunguzi inapitishwa juu ya specimen, vikosi kati ya atomi (vikosi vya van der Waals, vikosi vya capillary, kemikali bonding, vikosi vya umeme, na wengine) husababisha kuhamia juu na chini. Uchafuzi wa ncha ya uchunguzi imedhamiriwa na kupimwa kwa kutumia sheria ya Hooke ya elasticity, na habari hii hutumiwa kujenga picha za uso wa specimen na azimio katika ngazi ya atomiki (Kielelezo\(\PageIndex{16}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{16}\): STM na AFM zinatuwezesha kuona picha kwenye ngazi ya atomiki. (a) Picha hii ya STM ya uso safi ya dhahabu inaonyesha atomi binafsi za dhahabu zilizopangwa katika nguzo. (b) Picha hii ya AFM inaonyesha molekuli ndefu, kama ya nanocellulose, dutu iliyoundwa na maabara inayotokana na nyuzi za mimea. (mikopo a: mabadiliko ya kazi na “Erwinrossen” /Wikimedia Commons).

Zoezi\(\PageIndex{6}\)

1. Ambayo ina ukuzaji wa juu, darubini ya mwanga au microscope ya skanning probe?
2. Jina faida moja na upeo mmoja wa microscopy ya skanning probe.

Kielelezo\(\PageIndex{17}\): (mikopo “Brightfield”: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia; mikopo “Darkfield”: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia; mikopo “Tofauti ya awamu”: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani kwa Microbiology; mikopo “DIC”: mabadiliko ya kazi na Amerika Society kwa Microbiology; mikopo “Fluorescence”: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia; mikopo “Confocal”: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia; mikopo “Mbili-photon”: mabadiliko ya kazi na Alberto Diaspro, Paolo Bianchini, Giuseppe Vicidomini, Mario Faretta, Paola Ramoino , Cesare Usai).

Kielelezo\(\PageIndex{18}\): (mikopo “TEM”: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia; mikopo “SEM”: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia)

Kielelezo\(\PageIndex{19}\): mbinu za hadubini za skanning microscopes probe.

Dhana muhimu na Muhtasari

• Aina nyingi za hadubini hutumia teknolojia mbalimbali kuzalisha micrographs. Wengi ni muhimu kwa aina fulani ya specimen au maombi.
• Nuru hadubini hutumia lenses kuzingatia mwanga juu ya specimen ili kuzalisha picha. Microscopes za kawaida zinazotumiwa ni pamoja na uwanja mkali, darkfield, kulinganisha awamu-tofauti, tofauti ya kuingiliwa tofauti, fluorescence, confocal, na hadubini mbili za photon.
• hadubini ya elektroni inalenga elektroni kwenye specimen kwa kutumia sumaku, huzalisha ukuzaji mkubwa zaidi kuliko hadubini nyepesi. Microscope ya elektroni ya maambukizi (TEM) na microscope ya umeme ya skanning (SEM) ni aina mbili za kawaida
• Kuchunguza uchunguzi hadubini hutoa picha za ukuzaji mkubwa zaidi kwa kupima maoni kutoka kwa probes kali zinazoingiliana na specimen. Microscopes ya probe ni pamoja na microscope ya skanning tunneling (STM) na darubini ya nguvu ya atomiki (AFM).

maelezo ya chini

1. 1 “JEM-ARM200F Transmission Electron Microscope,” JEOL USA Inc, www.jeolusa.com/products/Tran... specifikationer. kupatikana 8/28/2015.

faharasa

atomiki nguvu microscope

skanning probe microscope ambayo inatumia probe nyembamba kwamba ni kupita tu juu specimen kupima vikosi kati ya atomi na probe

ya darubini

kuwa na eyepieces mbili

darubini mkali shamba

darubini ya mwanga ya kiwanja na lenses mbili; hutoa picha ya giza kwenye background mkali

coarse kulenga Knob

Knob juu ya darubini kwamba inazalisha harakati kiasi kikubwa kurekebisha lengo

kromofori

rangi kwamba kunyonya na kutafakari wavelengths fulani ya mwanga (kuwapa rangi)

lens condenser

lens juu ya darubini ambayo inalenga mwanga kutoka chanzo mwanga kwenye specimen

microscope confocal

darubini ya laser ya skanning ambayo inatumia rangi za fluorescent na lasers ya uchochezi ili kuunda picha tatu

darkfield microscope

darubini ya mwanga ya kiwanja inayozalisha picha mkali kwenye background ya giza; kawaida darubini iliyobadilishwa

kiwambo

sehemu ya darubini; kawaida ina disk chini ya hatua na mashimo ya ukubwa mbalimbali; inaweza kubadilishwa kuruhusu mwanga zaidi au chini kutoka chanzo mwanga kufikia specimen

microscope tofauti ya kuingilia kati

darubini ambayo inatumia mwanga polarized kuongeza tofauti

elektroni darubini

aina ya darubini ambayo inatumia mihimili ya elektroni ya muda mfupi badala ya mwanga ili kuongeza ukuzaji na azimio

faini kulenga Knob

Knob juu ya darubini kwamba inazalisha harakati ndogo ya kurekebisha lengo

fluorescence darubini

microscope ambayo inatumia fluorochromes asili au stains fluorescent kuongeza tofauti

fluorochromes

chromophores kwamba fluoresce (kunyonya na kisha emit mwanga)

taa

chanzo cha mwanga kwenye darubini

immunofluorescence

mbinu ambayo inatumia microscope ya fluorescence na fluorochromes maalum ya antibody kuamua kuwepo kwa vimelea maalum katika specimen

monocular

kuwa na jicho moja

lenses lengo

juu ya darubini mwanga, lenses karibu na specimen, kawaida ziko katika mwisho wa turrets

lens ya ocular

juu ya darubini, lens karibu na jicho (pia hujulikana eyepiece)

mafuta kuzamishwa lens

lens maalum ya lengo kwenye darubini iliyoundwa kutumiwa na mafuta ya kuzamishwa ili kuboresha azimio

darubini ya awamu-tofauti

darubini mwanga ambayo inatumia kuacha annular na sahani annular kuongeza tofauti

rheostat

kubadili dimmer ambayo inadhibiti ukubwa wa illuminator kwenye darubini ya mwanga

skanning elektroni darubini (SEM)

aina ya microscope ya elektroni ambayo hupunguza elektroni mbali na specimen, na kutengeneza picha ya uso

skanning uchunguzi microscope

darubini ambayo inatumia probe inayosafiri kwenye uso wa specimen kwa umbali wa mara kwa mara wakati sasa, ambayo ni nyeti kwa ukubwa wa pengo, inapimwa

skanning darubini ya handaki

microscope ambayo inatumia probe ambayo hupitishwa tu juu ya specimen, kama upendeleo wa voltage mara kwa mara hujenga uwezekano wa sasa umeme kati ya probe na specimen.

hatua

jukwaa la darubini ambayo slides huwekwa

ukuzaji wa jumla

katika darubini ya mwanga ni thamani iliyohesabiwa kwa kuzidisha ukuzaji wa ocular kwa kukuza kwa lenses za lengo

maambukizi ya elektroni microscope (TEM)

aina ya microscope ya elektroni ambayo inatumia boriti ya elektroni, iliyozingatia sumaku, ambayo hupita kupitia specimen nyembamba

darubini mbili-photon

darubini ambayo inatumia muda wa wavelength au mwanga wa infrared kwa fluoresce fluoresce katika specim

x-y knobs hatua mitambo

knobs kwenye darubini ambayo hutumiwa kurekebisha nafasi ya specimen juu ya uso wa hatua, kwa ujumla kuifanya moja kwa moja juu ya mwanga