2.4: Kuhifadhi vipimo vya Microscopic

Malengo ya kujifunza

• Tofauti kati ya stains rahisi na tofauti
• Eleza vipengele vya kipekee vya stains kawaida kutumika
• Eleza taratibu na jina la maombi ya kliniki ya Gram, endospore, asidi-haraka, capsule hasi, na uchafu wa flagella

Katika hali yao ya asili, seli nyingi na microorganisms ambazo tunazingatia chini ya darubini hazina rangi na tofauti. Hii inafanya kuwa vigumu, ikiwa haiwezekani, kuchunguza miundo muhimu ya seli na sifa zao za kutofautisha bila vielelezo vya matibabu. Tayari tumejitokeza kwa mbinu fulani zinazohusisha stains na dyes za fluorescent, na katika sehemu hii tutajadili mbinu maalum za maandalizi ya sampuli kwa undani zaidi. Hakika, mbinu nyingi zimeandaliwa kutambua viumbe vidogo maalum, miundo ya seli, Utaratibu wa DNA, au viashiria vya maambukizi katika sampuli za tishu, chini ya darubini. Hapa, tutazingatia mbinu muhimu zaidi za kliniki.

Kuandaa Vipimo vya Microscopy ya Mwanga

Katika mazingira ya kliniki, microscopes mwanga ni microscopes kawaida kutumika. Kuna aina mbili za msingi za maandalizi zinazotumiwa kutazama vielelezo na darubini ya mwanga: milima ya mvua na vielelezo vilivyowekwa.

Aina rahisi ya maandalizi ni mlima wa mvua, ambapo specimen imewekwa kwenye slide katika tone la kioevu. Baadhi ya mifano, kama tone la mkojo, tayari iko katika fomu ya kioevu na inaweza kuwekwa kwenye slide kwa kutumia dropper. Vipimo vilivyo imara, kama vile ngozi ya ngozi, vinaweza kuwekwa kwenye slide kabla ya kuongeza tone la kioevu ili kuandaa mlima wa mvua. Wakati mwingine kioevu kinachotumiwa ni maji tu, lakini mara nyingi stains huongezwa ili kuongeza tofauti. Mara kioevu kimeongezwa kwenye slide, kifuniko kinawekwa juu na specimen iko tayari kwa uchunguzi chini ya darubini.

Njia ya pili ya kuandaa sampuli kwa microscopy mwanga ni fixation. “Kurekebisha” kwa sampuli inahusu mchakato wa kuunganisha seli kwenye slide. Fixation mara nyingi hupatikana ama kwa kupokanzwa (kutengeneza joto) au kutibu kemikali. Mbali na kuunganisha specimen kwenye slide, fixation pia huua microorganisms katika specimen, kuacha harakati zao na kimetaboliki wakati wa kuhifadhi uadilifu wa vipengele vyao vya mkononi kwa uchunguzi.

Ili kurekebisha sampuli, safu nyembamba ya specimen imeenea kwenye slide (inayoitwa smear), na slide ni kisha huwaka moto juu ya chanzo cha joto (Kielelezo\(\PageIndex{1}\)). Marekebisho ya kemikali mara nyingi hupendekezwa kwa joto kwa vipimo vya tishu. Wakala wa kemikali kama vile asidi asetiki, ethanol, methanol, formaldehyde (formalin), na glutaraldehyde wanaweza kudhoofisha protini, kuacha athari biochemical, na utulivu miundo ya seli katika sampuli za tishu (Kielelezo\(\PageIndex{1}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{1}\): (a) Specimen inaweza kuwa joto-fasta kwa kutumia slide joto kama hii. (b) Njia nyingine ya kurekebisha joto ni kushikilia slide na smear juu ya microincinerator. (c) Sampuli hii ya tishu imewekwa katika suluhisho la formalini (pia inajulikana kama formaldehyde). Marekebisho ya kemikali huua microorganisms katika specimen, kuacha uharibifu wa tishu na kuhifadhi muundo wao ili waweze kuchunguzwa baadaye chini ya darubini. (mikopo a: mabadiliko ya kazi na Nina Parker; mikopo b: mabadiliko ya kazi na Nina Parker; mikopo c: mabadiliko ya kazi na “Chuo Kikuu cha Bristol” /YouTube)

Mbali na fixation, uchafu ni karibu kila mara kutumika kwa rangi baadhi ya vipengele vya specimen kabla ya kuchunguza chini ya darubini mwanga. Stains, au rangi, zina chumvi zilizojengwa na ion nzuri na ioni hasi. Kulingana na aina ya rangi, ioni nzuri au hasi inaweza kuwa chromophore (ion ya rangi); nyingine, ion isiyo na rangi inaitwa counterion. Ikiwa chromophore ni ion ya kushtakiwa vyema, stain inawekwa kama rangi ya msingi; ikiwa ion hasi ni chromophore, stain inachukuliwa kuwa rangi ya tindikali.

Dyes huchaguliwa kwa kudanganya kulingana na mali ya kemikali ya rangi na specimen inayozingatiwa, ambayo huamua jinsi rangi itaingiliana na specimen. Katika hali nyingi, ni vyema kutumia stain nzuri, rangi ambayo itachukuliwa na seli au viumbe vinavyozingatiwa, na kuongeza rangi kwa vitu vya riba ili kuwafanya wasimama nje dhidi ya historia. Hata hivyo, kuna matukio ambayo ni faida kutumia stain hasi, ambayo ni kufyonzwa na background lakini si kwa seli au viumbe katika specimen. Madoa mabaya hutoa muhtasari au silhouette ya viumbe dhidi ya background ya rangi (Kielelezo\(\PageIndex{2}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{2}\): (a) Seli hizi za Bacillus anthracis zimechukua violet ya kioo, stain ya msingi ya msingi. (b) Kielelezo hiki cha Spinoloricus, viumbe vya baharini microscopic, vimeharibiwa na rose bengal, stain nzuri ya tindikali. (c) Hizi B. megaterium kuonekana kuwa nyeupe kwa sababu wao si kufyonzwa hasi nyekundu stain kutumika kwa slide. (mikopo a: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa; mikopo b: mabadiliko ya kazi na Roberto Danovaro, Antonio Pusceddu, Cristina Gambi, Iben Heiner, Reinhardt Mobjerg Kristensen; mikopo c: mabadiliko ya kazi na Anh-Hue Tu)

Kwa sababu seli kawaida kushtakiwa vibaya kuta kiini, chromophores chanya katika dyes msingi huwa na fimbo na kuta za seli, na kufanya nao stains chanya. Hivyo, kawaida kutumika dyes msingi kama vile fuchsin msingi, kioo violet, malachite kijani, methylene bluu, na safranin kawaida kutumika kama stains chanya. Kwa upande mwingine, chromophores zilizosababishwa vibaya katika rangi za tindikali zinakabiliwa na kuta za seli za kushtakiwa vibaya, na kuzifanya kuwa mbaya. Kawaida kutumika dyes tindikali ni pamoja na asidi fuchsin, eosin, na rose bengal. Kielelezo\(\PageIndex{10}\) hutoa maelezo zaidi.

Mbinu zingine za uchafu zinahusisha matumizi ya rangi moja tu kwa sampuli; wengine huhitaji rangi zaidi ya moja. Kwa uchafu rahisi, rangi moja hutumiwa kusisitiza miundo fulani katika specimen. Taa rahisi kwa ujumla itafanya viumbe vyote katika sampuli kuonekana kuwa alama sawa, hata kama sampuli ina aina zaidi ya moja ya viumbe. Kwa upande mwingine, uchafu tofauti hufafanua viumbe kulingana na mwingiliano wao na stains nyingi. Kwa maneno mengine, viumbe viwili katika sampuli tofauti ya kubadilika inaweza kuonekana kuwa rangi tofauti. Mbinu tofauti za uchafu ambazo hutumiwa katika mazingira ya kliniki ni pamoja na uchafu wa Gram, uchafu wa asidi-haraka, uchafu wa endospore, uchafu wa flagella, na uchafu wa capsule. Kielelezo\(\PageIndex{11}\) hutoa maelezo zaidi juu ya mbinu hizi tofauti za uchafu.

Zoezi\(\PageIndex{1}\)

1. Eleza kwa nini ni muhimu kurekebisha specimen kabla ya kuiangalia chini ya darubini ya mwanga.
2. Ni aina gani za specimens zinapaswa kuwa na kemikali fasta kinyume na joto-fasta?
3. Kwa nini rangi ya tindikali inaweza kuguswa tofauti na specimen iliyotolewa kuliko rangi ya msingi?
4. Eleza tofauti kati ya stain nzuri na stain hasi.
5. Eleza tofauti kati ya uchafu rahisi na tofauti.

Gram Madoa

Utaratibu wa stain ya Gram ni utaratibu tofauti wa uchafu unaohusisha hatua nyingi. Ilianzishwa na microbiologist wa Denmark Hans Christian Gram mwaka 1884 kama njia bora ya kutofautisha kati ya bakteria yenye aina tofauti za kuta za seli, na hata leo inabakia mojawapo ya mbinu za kudanganya mara nyingi zinazotumiwa. Hatua za utaratibu wa stain ya Gram zimeorodheshwa hapa chini na zinaonyeshwa kwenye Kielelezo\(\PageIndex{3}\).

1. Kwanza, violet ya kioo, taa ya msingi, hutumiwa kwenye smear ya joto, ikitoa seli zote rangi ya zambarau.
2. Kisha, iodini ya Gram, mordant, imeongezwa. Mordant ni dutu inayotumika kuweka au kutuliza stains au dyes; katika kesi hii, iodini ya Gram hufanya kama wakala wa utegaji ambao hujumuisha violet ya kioo, na kufanya kioo violet—iodini tata na kukaa zilizomo katika tabaka nene za peptidoglycan katika kuta za seli.
3. Kisha, wakala wa kupungua huongezwa, kwa kawaida ethanol au ufumbuzi wa acetone/ethanol. Seli zilizo na tabaka kubwa za peptidoglycan katika kuta zao za seli haziathiriwa sana na wakala wa decolorizing; kwa ujumla huhifadhi rangi ya violet ya kioo na kubaki zambarau. Hata hivyo, wakala wa decolorizing husafisha kwa urahisi rangi nje ya seli na tabaka nyembamba za peptidoglycan, na kuifanya tena bila rangi.
4. Hatimaye, counterstain ya sekondari, kwa kawaida safranini, imeongezwa. Hii inadanganya seli za decolorized nyekundu na hazionekani zaidi katika seli ambazo bado zina rangi ya violet ya kioo.

Kielelezo\(\PageIndex{1}\): Madoa ya Gramu-ni mbinu tofauti ya uchafu ambayo hutumia taa ya msingi na kinyume cha sekondari ili kutofautisha kati ya bakteria ya gramu-chanya na gramu-hasi.

Seli za rangi ya zambarau, za violet za violet zinajulikana kama seli za gramu-chanya, wakati seli nyekundu, za safranini-rangi ni gramu-hasi (Kielelezo\(\PageIndex{4}\)). Hata hivyo, kuna mambo kadhaa muhimu katika kutafsiri matokeo ya stain ya Gram. Kwanza, seli za bakteria za zamani zinaweza kuwa na uharibifu wa kuta zao za seli zinazowafanya zionekane gramu-hasi hata kama spishi ni gramu-chanya. Kwa hiyo, ni bora kutumia tamaduni mpya za bakteria kwa uchafu wa Gram. Pili, makosa kama vile kuondoka kwenye decolorizer muda mrefu sana yanaweza kuathiri matokeo. Katika hali nyingine, seli nyingi zitaonekana gramu-chanya wakati wachache huonekana gramu-hasi (kama kwenye Mchoro\(\PageIndex{4}\)). Hii inaonyesha uharibifu kwa seli za mtu binafsi au kwamba decolorizer iliachwa kwa muda mrefu sana; seli bado zinapaswa kuainishwa kama gramu-chanya ikiwa zote ni spishi moja badala ya utamaduni mchanganyiko.

Mbali na ushirikiano wao tofauti na rangi na mawakala wa kupungua, tofauti za kemikali kati ya seli za gramu-chanya na gramu-hasi zina athari nyingine na umuhimu wa kliniki. Kwa mfano, uchafu wa Gram unaweza kusaidia madaktari kuainisha vimelea vya bakteria katika sampuli katika makundi yanayohusiana na mali maalum. Bakteria ya Gram-hasi huwa na sugu zaidi kwa antibiotics fulani kuliko bakteria ya gramu-chanya. Tutazungumzia hii na matumizi mengine ya uchafu wa Gram kwa undani zaidi katika sura za baadaye.

Kielelezo\(\PageIndex{4}\): Katika specimen hii, bakteria ya gram-chanya Staphylococcus aureus inabakia rangi ya violet ya kioo hata baada ya wakala wa decolorizing kuongezwa. Gram-hasi Escherichia coli, bakteria ya kawaida ya kudhibiti ubora wa Gram, ni decolorized, na inaonekana tu baada ya kuongeza ya pink counterstain safranin. (mikopo: mabadiliko ya kazi na Nina Parker)

Zoezi\(\PageIndex{2}\)

1. Eleza jukumu la iodini ya Gram katika utaratibu wa stain ya Gram.
2. Eleza jukumu la pombe katika utaratibu wa stain ya Gram.
3. Nini rangi ni seli za gramu-chanya na gramu-hasi, kwa mtiririko huo, baada ya utaratibu wa stain ya Gram?

Mwelekeo wa kliniki: Sehemu ya 3

Kuangalia specimen ya Cindy chini ya darkfield darkfield imetoa fundi na baadhi ya dalili muhimu kuhusu utambulisho wa microbe kusababisha maambukizi yake. Hata hivyo, habari zaidi inahitajika kufanya uchunguzi wa kukamilisha. Fundi anaamua kufanya taa ya Gram ya specimen. Mbinu hii hutumiwa kama hatua ya mwanzo katika kutambua bakteria ya pathogenic. Baada ya kukamilisha utaratibu wa stain ya Gram, fundi anaona slide chini ya darubini ya brightfield na anaona zambarau, makundi ya zabibu ya seli za spherical (Kielelezo\(\PageIndex{5}\)).

Zoezi\(\PageIndex{3}\)

1. Je! Bakteria hizi ni gramu-chanya au gramu-hasi?
2. Hii inafunua nini kuhusu kuta zao za seli?

Kielelezo\(\PageIndex{5}\): Specimen ya Cindy (mikopo: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia)

Acid-Fast Stains

Madoa ya haraka ya asidi ni mbinu nyingine inayotumiwa, tofauti ya uchafu ambayo inaweza kuwa chombo muhimu cha uchunguzi. Taa ya asidi-haraka ina uwezo wa kutofautisha aina mbili za seli za gramu-chanya: wale ambao wana asidi ya mycolic ya wax katika kuta zao za seli, na wale ambao hawana. Mbinu mbili tofauti za uchafu wa asidi-haraka ni mbinu ya Ziehl-Neelsen na mbinu ya Kinyoun. Wote hutumia carbolfuchsin kama stain ya msingi. Nta, seli za asidi-haraka huhifadhi carbolfuchsin hata baada ya wakala wa decolorizing (ufumbuzi wa asidi-pombe) hutumiwa. Counterstain ya sekondari, bluu ya methylene, hutumiwa, ambayo hutoa seli zisizo za asidi-haraka za bluu.

Tofauti ya msingi kati ya mbinu mbili za carbolfuchsin ni kama joto hutumiwa wakati wa mchakato wa uchafu wa msingi. Njia ya Ziehl-Neelsen hutumia joto kuingiza carbolfuchsin ndani ya seli za asidi-haraka, wakati njia ya Kinyoun haitumii joto. Mbinu zote mbili ni zana muhimu za uchunguzi kwa sababu idadi ya magonjwa maalum husababishwa na bakteria ya asidi-haraka (AFB). Ikiwa AFB iko kwenye sampuli ya tishu, rangi yao nyekundu au nyekundu inaweza kuonekana wazi dhidi ya background ya bluu ya seli za tishu zinazozunguka (Kielelezo\(\PageIndex{6}\)).

Zoezi\(\PageIndex{4}\)

Kwa nini madhara ya asidi-haraka yanafaa?

Kutumia Microscopy Kutambua kifua kikuu

Mycobacterium kifua kikuu, bakteria inayosababisha kifua kikuu, inaweza kuonekana katika vielelezo kulingana na kuwepo kwa bacilli ya asidi-haraka. Mara nyingi, smear imeandaliwa kutoka kwa sampuli ya sputum ya mgonjwa na kisha kubadilika kwa kutumia mbinu ya Ziehl-Neelsen (Kielelezo\(\PageIndex{6}\)). Ikiwa bakteria ya asidi-haraka imethibitishwa, kwa ujumla hupandwa ili kufanya kitambulisho chanya. Tofauti za mbinu hii zinaweza kutumika kama hatua ya kwanza katika kuamua kama M. kifua kikuu au bakteria nyingine za asidi-haraka zipo, ingawa sampuli kutoka mahali pengine mwilini (kama vile mkojo) zinaweza kuwa na aina nyingine za Mycobacterium.

Njia mbadala ya kuamua uwepo wa M. kifua kikuu ni immunofluorescence. Katika mbinu hii, antibodies ya fluorochrome iliyoandikwa hufunga kwa M. kifua kikuu, ikiwa iko. Dyes maalum ya fluorescent ya antibody inaweza kutumika kutazama mycobacteria na microscope ya fluorescence.

Kielelezo\(\PageIndex{6}\): Ziehl-Neelsen Madoa ina rendered seli hizi Mycobacterium kifua kikuu nyekundu na jirani ukuaji kiashiria kati ya bluu. (mikopo: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia)

capsule Madoa

Bakteria na chachu fulani zina muundo wa nje wa kinga unaoitwa capsule. Kwa kuwa uwepo wa capsule ni moja kwa moja kuhusiana na virulence ya microbe (uwezo wake wa kusababisha ugonjwa), uwezo wa kuamua kama seli katika sampuli zina vidonge ni chombo muhimu cha uchunguzi. Vidonge haviingizi dyes ya msingi; kwa hiyo, mbinu mbaya ya uchafu (kudanganya karibu na seli) hutumiwa kwa uchafu wa capsule. Dye hudanganya background lakini haipenye vidonge, vinavyoonekana kama halos karibu na mipaka ya seli. Specimen haina haja ya kuwa na joto fasta kabla ya uchafu hasi.

Mbinu moja ya kawaida ya uchafu hasi kwa kutambua chachu iliyowekwa na bakteria ni kuongeza matone machache ya wino wa India au nigrosini kwa specimen. Vipande vingine vya capsular pia vinaweza kutumiwa kuharibu vibaya seli zilizowekwa (Kielelezo\(\PageIndex{7}\)). Vinginevyo, mbinu chanya na hasi Madoa inaweza kuwa pamoja na taswira vidonge: doa chanya rangi mwili wa seli, na doa hasi rangi background lakini si capsule, na kuacha halo kuzunguka kila kiini.

Kielelezo\(\PageIndex{7}\): (a) wino wa India ulitumiwa kudanganya historia karibu na seli hizi za neoformans ya Cryptococcus ya chachu. Halos zinazozunguka seli ni vidonge vya polysaccharide. (b) Dyes ya violet ya violet na shaba ya sulfate haiwezi kupenya seli za Bacillus zilizowekwa kwenye sampuli hii mbaya. Seli zilizoingizwa zinaonekana kuwa na halo ya rangi ya bluu. (mikopo a: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia; mikopo b: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia)

Zoezi\(\PageIndex{5}\)

Je, uchafu hasi hutusaidia kutazama vidonge?

Endospore Madoa

Endospores ni miundo zinazozalishwa ndani ya seli fulani za bakteria zinazowawezesha kuishi hali mbaya. Madoa ya Gram peke yake hayawezi kutumiwa kutazama endospores, ambazo zinaonekana wazi wakati seli za Gram-stained zinapotazamwa. Madoa ya Endospore hutumia stains mbili ili kutofautisha endospores kutoka kwenye seli zote. Njia ya Schaeffer-Fulton (mbinu ya kawaida ya kudanganya endospore) hutumia joto kushinikiza taa ya msingi (kijani ya malachite) ndani ya endospore. Kuosha na maji hupunguza kiini, lakini endospore huhifadhi taa ya kijani. Kiini ni kisha kinyume na pink na safranini. Picha inayoonyesha inaonyesha sura na eneo la endospores, ikiwa zipo. Endospores ya kijani itaonekana ama ndani ya seli za mimea ya pink au kama tofauti na seli za pink kabisa. Ikiwa hakuna endospores zilizopo, basi seli za mboga za pink zitaonekana (Kielelezo\(\PageIndex{8}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{8}\): Maandalizi ya kubadilika ya Bacillus subtilis kuonyesha endospores kama kijani na seli za mimea kama pink. (mikopo: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia)

Mbinu za kudanganya Endospore ni muhimu kwa kutambua Bacillus na Clostridium, genera mbili za bakteria zinazozalisha endospore ambazo zina aina muhimu za kliniki. Miongoni mwa wengine, B. anthracis (ambayo husababisha anthrax) imekuwa ya riba hasa kwa sababu ya wasiwasi kwamba spora zake zinaweza kutumika kama wakala wa biotorroriorid. C. difficile ni aina muhimu hasa inayohusika na maambukizi ya kawaida ya hospitali inayojulikana kama “C. tofauti.”

Zoezi\(\PageIndex{6}\)

Je, endospore inadanganya mfano wa uchafu mzuri, hasi, au tofauti?

flagella Madoa

Flagella (umoja: flagellum) ni miundo ya kiini kama mkia inayotumiwa kwa kukokotoa na baadhi ya bakteria, archaea, na eukaryotes. Kwa sababu ni nyembamba sana, kwa kawaida flagella haiwezi kuonekana chini ya darubini nyepesi bila mbinu maalumu ya uchafu wa flagella. Madoa ya Flagella huongeza flagella kwa kutumia kwanza mordant (kwa ujumla asidi ya tannic, lakini wakati mwingine alum ya potasiamu), ambayo huvaa flagella; basi specimen inaharibiwa na pararosaniline (kawaida) au fuchsin ya msingi (Kielelezo\(\PageIndex{9}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{9}\): Taa ya flagella ya Bacillus cereus, sababu ya kawaida ya ugonjwa wa chakula, inaonyesha kwamba seli zina flagella nyingi, zinazotumiwa kwa locomotion. (mikopo: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa)

Ingawa uchafu wa flagella ni kawaida katika mazingira ya kliniki, mbinu hiyo hutumiwa kwa kawaida na wanabiolojia, kwani mahali na idadi ya flagella inaweza kuwa na manufaa katika kuainisha na kutambua bakteria katika sampuli. Wakati wa kutumia mbinu hii, ni muhimu kushughulikia specimen kwa uangalifu mkubwa; flagella ni miundo maridadi ambayo inaweza kuharibiwa au kuvutwa kwa urahisi, kuacha majaribio ya kupata kwa usahihi na kuhesabu idadi ya flagella.

Kielelezo\(\PageIndex{10}\): (mikopo “stains msingi”: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa; mikopo “tindikali stains”: mabadiliko ya kazi na Roberto Danovaro, Antonio Dell'Anno, Antonio Pusceddu, Cristina Gambi, Iben Heiner, Reinhardt Mobjerg Kristensen; mikopo “Madoa mabaya”: muundo ya kazi na Anh-Hue Tu)

Kielelezo\(\PageIndex{11}\): (mikopo “Gram stain”: mabadiliko ya kazi na Nina Parker; mikopo “Acid-haraka stain”: mabadiliko ya kazi na Society American kwa Microbiology; mikopo “Endospore stain”: mabadiliko ya kazi na Society American kwa Microbiology; mikopo “Capsule stain”: mabadiliko ya kazi na Society American kwa Microbiology; mikopo “Flagella stain”: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Udhibiti wa Magonjwa na Kuzuia)

Kuandaa Vipimo vya Microscopy ya Electron

Sampuli za kuchambuliwa kwa kutumia TEM lazima ziwe na sehemu nyembamba sana. Lakini seli ni laini sana kukata nyembamba, hata kwa visu vya almasi. Ili kukata seli bila uharibifu, seli zinapaswa kuingizwa kwenye resin ya plastiki na kisha zikaharibika kwa njia ya mfululizo wa soaks katika ufumbuzi wa ethanol (50%, 60%, 70%, na kadhalika). Ethanol inachukua nafasi ya maji ndani ya seli, na resin hupasuka katika ethanol na huingia kwenye seli, ambako inaimarisha. Kisha, sehemu nyembamba hukatwa kwa kutumia kifaa maalumu kinachoitwa ultramicrotome (Kielelezo\(\PageIndex{12}\)). Hatimaye, sampuli ni fasta kwa faini shaba waya au kaboni-fiber gridi na kubadilisha-si na dyes rangi, lakini na vitu kama uranyl acetate au osmium tetroksidi, ambayo yana elektroni-zenye chuma nzito atomi.

Kielelezo\(\PageIndex{12}\): (a) Ultramicrotome kutumika kuandaa sampuli kwa TEM. (b) fundi anatumia ultramicrotome kwa kipande specimen katika sehemu nyembamba. (mikopo a: muundo wa kazi na “Frost Museum” /Flickr; mikopo b: mabadiliko ya kazi na Marekani Samaki na Wanyamapori Huduma Northeast Region)

Wakati sampuli zimeandaliwa kwa kutazama kwa kutumia SEM, lazima pia zimeharibika kwa kutumia mfululizo wa ethanol. Hata hivyo, ni lazima hata kavu kuliko ni muhimu kwa TEM. Hatua muhimu ya kukausha na dioksidi ya kioevu ya kioevu chini ya shinikizo hutumiwa kuondoa maji kutoka kwa specimen. Baada ya kukausha, vielelezo vinatengenezwa na chuma kwa kugonga atomi mbali na lengo la palladium, na chembe za juhudi. Mchoro wa sputter huzuia vielelezo vya kushtakiwa na boriti ya elektroni ya SEM.

Zoezi\(\PageIndex{7}\)

1. Kwa nini ni muhimu kuharibu seli kabla ya kuchunguza chini ya darubini ya elektroni?
2. Jina kifaa kinachotumiwa kuunda sehemu nyembamba za sampuli kwa microscopy ya elektroni.

Kutumia Microscopy Kutambua Kaswende

Wakala wa causative wa kaswende ni Treponema pallidum, kiini chenye kubadilika, cha ond (spirochete) ambacho kinaweza kuwa nyembamba sana (<0.15 μm) na kinafanana na index ya refractive ya kati, na kuifanya iwe vigumu kuona kwa kutumia hadubini ya brightfield. Zaidi ya hayo, spishi hii haijawahi kufanikiwa kukuzwa katika maabara kwenye katikati ya bandia; kwa hiyo, utambuzi unategemea utambulisho wa mafanikio kwa kutumia mbinu microscopic na serology (uchambuzi wa maji ya mwili, mara nyingi kutafuta kingamwili kwa kisababishi magonjwa). Kwa kuwa fixation na Madoa bila kuua seli, darkfield hadubini ni kawaida kutumika kwa ajili ya kuchunguza sampuli kuishi na kuangalia harakati zao. Hata hivyo, mbinu nyingine zinaweza pia kutumika. Kwa mfano, seli zinaweza kuenea na chembe za fedha (katika sehemu za tishu) na kuzingatiwa kwa kutumia darubini ya mwanga. Inawezekana pia kutumia fluorescence au microscopy ya elektroni ili kuona Treponema (Kielelezo\(\PageIndex{13}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{13}\): (a) Kuishi, bila kubadilika Treponema pallidum spirochetes inaweza kutazamwa chini ya darkfield darubini. (b) Katika picha hii ya brightfield, stain ya fedha ya Steiner iliyobadilishwa hutumiwa kutazama T. pallidum spirochetes. Ingawa stain huua seli, huongeza tofauti ili kuwafanya iwe wazi zaidi. (c) Wakati haitumiwi kwa kupima kiwango cha uchunguzi, T. pallidum pia inaweza kuchunguzwa kwa kutumia skanning hadubini ya elektroni. (mikopo a: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa; mikopo b: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa; mikopo c: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa)

Katika mazingira ya kliniki, immunofluorescence ya moja kwa moja mara hutumiwa kutambua Treponema. Antibody ya msingi, isiyosababishwa inaunganisha moja kwa moja kwenye uso wa pathogen, na antibodies za sekondari “zimewekwa” na taa ya fluorescent inayoambatana na antibody ya msingi. Antibodies nyingi za sekondari zinaweza kushikamana na kila antibody ya msingi, kukuza kiasi cha stain zilizounganishwa na kila kiini cha Treponema, na kuwafanya iwe rahisi kuona (Kielelezo\(\PageIndex{14}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{14}\): Immunofluorescence isiyo ya moja kwa moja inaweza kutumika kutambua T. pallidum, wakala wa causative wa kaswisi, katika specimen.

Maandalizi na Madoa kwa Microscopes nyingine

Sampuli za fluorescence na microscopy ya confocal zimeandaliwa sawa na sampuli kwa microscopy mwanga, isipokuwa kwamba rangi ni fluorochromes. Stains mara nyingi hupunguzwa katika kioevu kabla ya kuomba kwenye slide. Baadhi ya dyes ambatanisha na antibody doa protini maalum juu ya aina maalum ya seli (immunofluorescence); wengine wanaweza ambatanisha na molekuli DNA katika mchakato unaoitwa fluorescence katika situ hybridization (FISH), na kusababisha seli kubadilika kulingana na kama wana mlolongo maalum wa DNA.

Maandalizi ya sampuli ya microscopy mbili za photon ni sawa na microscopy ya fluorescence, ila kwa matumizi ya rangi ya infrared Vipimo vya STM vinahitaji kuwa kwenye uso safi sana na atomically laini. Mara nyingi ni mica iliyotiwa na Au (111). Mvuke wa toluene ni fixative ya kawaida.

Zoezi\(\PageIndex{8}\)

Ni tofauti gani kuu kati ya kuandaa sampuli kwa microscopy ya fluorescence dhidi ya hadubini ya mwanga?

Unganisha na Kujifunza

Chuo Kikuu cha Cornell Mafunzo ya Uchunguzi katika Microscopy inatoa mfululizo wa matatizo ya kliniki kulingana na matukio halisi ya maisha. Kila utafiti kesi anatembea wewe kupitia tatizo kliniki kwa kutumia mbinu sahihi katika hadubini katika kila hatua.

Mtazamo wa Hospitali

Kutokana na matokeo ya stain ya Gram, fundi sasa anajua kwamba maambukizi ya Cindy husababishwa na bakteria ya spherical, gram-chanya ambayo huunda makundi ya zabibu, ambayo ni ya kawaida ya bakteria ya staphylococcal. Baada ya upimaji wa ziada, fundi huamua kuwa bakteria hizi ni spishi muhimu za kiafya zinazojulikana kama Staphylococcus aureus, mkosaji wa kawaida katika maambukizi ya jeraha. Kwa sababu baadhi ya Matatizo ya S. aureus yanakabiliwa na antibiotics nyingi, maambukizi ya ngozi yanaweza kuenea kwa maeneo mengine ya mwili na kuwa makubwa, wakati mwingine hata kusababisha kukatwa au kifo ikiwa antibiotics sahihi hazitumiwi.

Baada ya kupima antibiotics kadhaa, maabara yanaweza kutambua moja ambayo inafaa dhidi ya aina hii ya S. aureus. Daktari wa Cindy haraka anaelezea dawa na inasisitiza umuhimu wa kuchukua kozi nzima ya antibiotics, hata kama maambukizi yanaonekana kufuta kabla ya kipimo cha mwisho kilichopangwa. Hii inapunguza hatari ya kuwa bakteria yoyote yenye sugu hasa inaweza kuishi, na kusababisha maambukizi ya pili au kuenea kwa mtu mwingine.

Microscopy na Upinzani wa Antib

Kama matumizi ya antibiotics yameenea katika dawa, pamoja na kilimo, viumbe vidogo vimebadilika kuwa sugu zaidi. Matatizo ya bakteria kama vile S. aureus (MRSA) sugu ya methicillin, ambayo imeendeleza kiwango cha juu cha upinzani dhidi ya antibiotics nyingi, ni tatizo linalozidi kuhangaika, kiasi kwamba utafiti unaendelea kuendeleza antibiotics mpya na yenye mseto zaidi.

Microscopy ya fluorescence inaweza kuwa na manufaa katika kupima ufanisi wa antibiotics mpya dhidi ya matatizo sugu kama MRSA. Katika mtihani wa antibiotic moja mpya inayotokana na bakteria ya baharini, MC21-A (bromophene), watafiti walitumia rangi ya fluorescent SYTOX Green ili kudanganya sampuli za MRSA. SYTOX Green mara nyingi hutumiwa kutofautisha seli zilizokufa kutoka seli zilizo hai, na hadubini ya fluorescence. Seli za kuishi hazitaweza kunyonya rangi, lakini seli zilizouawa na antibiotic zitachukua rangi, kwani antibiotic imeharibu utando wa seli za bakteria. Katika kesi hii, bakteria MRSA kwamba alikuwa wazi kwa MC21-A alifanya, kwa kweli, kuonekana kijani chini ya darubini fluorescence, na kusababisha watafiti kuhitimisha kuwa ni antibiotic ufanisi dhidi MRSA.

Bila shaka, baadhi wanasema kuwa kuendeleza antibiotics mpya itasababisha tu microbes zaidi ya antibiotic sugu, kinachojulikana superbugs ambayo inaweza spawn magonjwa kabla ya matibabu mapya yanaweza kuendelezwa. Kwa sababu hii, wataalamu wengi wa afya wanaanza kutumia busara zaidi katika kuagiza antibiotics. Ingawa antibiotics mara moja ziliwekwa mara kwa mara kwa magonjwa ya kawaida bila utambuzi wa uhakika, madaktari na hospitali wana uwezekano mkubwa zaidi wa kufanya upimaji wa ziada ili kuamua kama antibiotic ni muhimu na inafaa kabla ya kuagiza.

Mgonjwa mgonjwa anaweza kukataa njia hii ya ajabu ya kuagiza antibiotics. Kwa mgonjwa ambaye anataka tu kujisikia vizuri haraka iwezekanavyo, faida ya uwezo wa kuchukua antibiotic inaweza kuonekana kuwa zaidi ya hatari yoyote ya haraka ya afya ambayo inaweza kutokea kama antibiotic haina ufanisi. Lakini kwa wakati gani hatari za matumizi ya antibiotic yaliyoenea huzidi hamu ya kuitumia katika kesi za kibinafsi?

Dhana muhimu na Muhtasari

• Sampuli lazima ziandaliwa vizuri kwa microscopy. Hii inaweza kuhusisha uchafu, fixation, na/au kukata sehemu nyembamba.
• Mbinu mbalimbali za uchafu zinaweza kutumika kwa hadubini ya mwanga, ikiwa ni pamoja na uchafu wa Gram, uchafu wa asidi-haraka, uchafu wa capsule, uchafu wa endospore, na uchafu wa flagella.
• Sampuli za TEM zinahitaji sehemu nyembamba sana, wakati sampuli za SEM zinahitaji mipako ya sputter.
• Maandalizi ya microscopy ya fluorescence ni sawa na ile ya microscopy mwanga, isipokuwa kwamba fluorochromes hutumiwa.