20.1：单克隆和多克隆抗体的实际应用

学习目标

• 比较单克隆和多克隆抗体的开发、使用和特征
• 解释抗体交叉反应性的性质以及为什么这对于单克隆抗体来说不是什么问题

临床重点：第 1 部分

在一次不幸的事件中，一名与成瘾作斗争的医护人员被抓到偷了止痛药注射器，然后用装有未知物质的注射器代替了止痛药。 医院立即解雇了这名员工并将其逮捕；但是，与他共事的两名患者后来经检测呈艾滋病毒阳性。

尽管没有证据表明感染源于受污染的注射器，但医院的公共卫生医生立即采取了措施，以确定是否有其他患者处于危险之中。 尽管该工作人员只受雇了很短的时间，但已确定他接触了1300多名患者。 医院决定联系所有这些患者并对他们进行艾滋病毒检测。

练习\(\PageIndex{1}\)

1. 为什么医院觉得有必要对每位患者进行艾滋病毒检测？
2. 可以使用哪些类型的测试来确定患者是否感染了艾滋病毒？

除了对我们的正常免疫反应至关重要外，抗体还为研究和诊断目的提供了强大的工具。 抗体的高特异性使其成为检测和定量从药物到血清蛋白再到微生物等各种靶点的绝佳工具。 通过体外测定，抗体可用于沉淀可溶性抗原、凝集（团块）细胞、在补体的帮助下对细菌进行刺激和杀死，以及中和药物、毒素和病毒。

抗体的特异性来自于在可变区域内形成的抗原结合位点，这些区域具有独特的氨基酸模式，只能通过提供互补电荷和非共价键的分子序列与靶抗原结合。 但是，抗体特异性存在局限性。 有些抗原在化学上非常相似，以至于出现交叉反应性；换句话说，针对一种抗原产生的抗体与化学相似但不同的抗原结合。 以一种由具有多个表位的单一蛋白质组成的抗原为例（图\(\PageIndex{1}\)）。 这种单一蛋白可以刺激许多不同抗体的产生，其中一些抗体可能与其他蛋白质上化学上相同的表位结合。

抗体和亲和力低的抗原之间更有可能发生交叉反应性。 亲和力可以通过实验确定，是衡量抗体结合位点和表位之间结合强度的指标，而亲和力是抗体-抗原复合物（可能有多个结合位点）中所有相互作用的总强度。 亲和力受亲和力、抗原表位的结构排列和抗体的可变区域的影响。 如果抗体对特定抗原具有较高的亲和力/亲和力，则它不太可能与其亲和力/亲和力较低的抗原发生交叉反应。

图\(\PageIndex{1}\)：抗体与称为表位的抗原上的特定区域结合。 单个抗原可以具有针对不同特异性抗体的多个抗原表位。

练习\(\PageIndex{2}\)

1. 什么特性使抗体可用于研究和临床诊断？
2. 什么是交叉反应性？为什么会发生？

生产多克隆抗体

用于研究和诊断目的的抗体通常是通过向实验动物（例如兔子或山羊）注射特定的抗原来获得的。 在几周内，动物的免疫系统将产生高水平的抗原特异性抗体。 这些抗体可以在抗血清中收集，抗血清是暴露于抗原后从动物身上收集的全血清。 由于大多数抗原是具有多个表位的复杂结构，因此它们会在实验动物体内产生多种抗体。 这种所谓的多克隆抗体反应也是人体免疫系统感染的典型反应。 因此，从动物身上提取的抗血清将含有来自多个 B 细胞克隆的抗体，每个 B 细胞对抗原上的特定表位有反应（图\(\PageIndex{2}\)）。

实验动物在用于生产抗血清时通常至少注射两次抗原。 第二次注射将激活产生针对抗原的 IgG 类抗体的记忆细胞。 记忆细胞也会经历亲和力成熟，从而产生具有更高平均亲和力的抗体库。 亲和力成熟是由于免疫球蛋白基因可变区域的突变而发生的，从而导致 B 细胞的抗原结合位点略有改变。 在再次暴露于抗原时，那些能够产生具有更高亲和力的抗原结合位点的抗体的B细胞将被刺激增殖并产生比低亲和力的同伴更多的抗体。 佐剂是一种激发免疫系统广泛激活从而刺激更多抗体产生的化学物质，通常在注射前与抗原混合。

从动物身上获得的抗血清不仅含有针对实验室人工引入的抗原的抗体，而且还含有动物一生中接触过的任何其他抗原的抗体。 因此，在使用抗体进行研究或诊断检测之前，必须先对抗血清进行 “纯化” 以去除其他抗体。

图\(\PageIndex{2}\)：此图说明了收获因抗原而产生的多克隆抗体的过程。

多克隆抗血清的临床用途

多克隆抗血清用于许多临床试验，这些试验旨在确定患者是否正在产生针对特定病原体的抗体。 尽管这些测试无疑是强大的诊断工具，但它们有其局限性，因为它们是确定特定病原体是否存在的间接手段。 基于多克隆反应的测试有时会导致假阳性结果，换句话说，即确认存在实际上不存在的抗原的测试。 基于抗体的测试还可能导致假阴性结果，当测试未能检测到实际上存在的抗体时，就会出现假阴性结果。

抗体测试的准确性可以用测试灵敏度和测试特异性来描述。 检测灵敏度是指当患者确实被感染时获得阳性检测结果的概率。 如果测试灵敏度高，则假阴性的概率很低。 另一方面，检测特异性是指患者未被感染时获得阴性检测结果的概率。 如果测试具有很高的特异性，则假阳性的概率很低。

误报通常是由于交叉反应而发生的，当来自不同病原体的抗原表位与正在测试的病原体上发现的抗原表位相似时，就会发生这种情况。 因此，基于抗体的检测通常仅用作筛查测试；如果结果为阳性，则使用其他确认性测试来确保结果不是假阳性。

例如，可使用与丙型肝炎病毒抗原结合的抗体对疑似患有丙型肝炎的患者的血液样本进行病毒筛查。 如果患者确实感染了丙型肝炎病毒，则抗体将与抗原结合，产生阳性检测结果。 如果患者没有感染丙型肝炎病毒，则抗体通常不会与任何东西结合，检测结果应为阴性；但是，如果患者以前感染过引发与丙型肝炎交叉反应的抗体的各种病原体中的任何一种，则可能出现假阳性病毒抗原。 丙型肝炎的抗体检测灵敏度高（假阴性的概率很低），但特异性低（假阳性的概率很高）。 因此，检测结果呈阳性的患者必须进行第二次确认性检测，以排除出现假阳性的可能性。 确认性测试是一种更昂贵且耗时的测试，它直接测试血液中是否存在丙型肝炎病毒 RNA。 只有在确认性检测结果呈阳性后，患者才能被确诊为丙型肝炎感染。 如果由于任何原因，患者的免疫系统没有产生可检测的抗体水平，基于抗体的测试可能会导致假阴性。 对于某些疾病，感染后可能需要几周时间，免疫系统才能产生足够的抗体以超过测定阈值。 在免疫功能低下患者中，免疫系统可能无法产生可检测水平的抗体。

使用抗体产生作为疾病指标的另一个局限性是，血液中的抗体将在感染清除后很长一段时间内持续存在。 根据感染类型的不同，抗体将存在好几个月；有时，抗体可能会在患者的余生中存在。 因此，基于抗体的检测呈阳性仅表示患者在某个时间点被感染；并不能证明感染处于活动状态。

除了在诊断中的作用外，多克隆抗血清还可以激活补体，检测临床和食品行业环境中是否存在细菌，并进行各种沉淀反应，可以检测和量化血清蛋白、病毒或其他抗原。 但是，由于多克隆抗血清中存在抗体的许多特异性，因此抗血清很有可能与个体从未接触过的抗原发生交叉反应。 因此，在使用多克隆抗血清时，我们必须始终考虑出现假阳性结果的可能性。

练习\(\PageIndex{3}\)

1. 什么是误报？误报发生的原因有哪些？
2. 什么是假阴性？发生误报的原因有哪些？
3. 如果患者在高度敏感的检测中检测结果为阴性，则该人感染该病原体的可能性有多大？

生产单克隆抗体

与使用多克隆抗血清相比，某些类型的测定需要更好的抗体特异性和亲和力。 为了达到这种高特异性，所有抗体都必须以高亲和力与单个表位结合。 这种高特异性可由单克隆抗体 (mAb) 提供。 表\(\PageIndex{1}\)比较了单克隆和多克隆抗体的一些重要特征。

与活体动物产生的多克隆抗体不同，单克隆抗体是使用组织培养技术在体外产生的。单克隆抗体是通过用特定抗原对动物（通常是小鼠）进行多次免疫而产生的。 然后从免疫动物的脾脏中取出 B 细胞。 由于正常 B 细胞无法永久增殖，因此它们会与称为骨髓瘤细胞的不朽癌性 B 细胞融合，产生杂交瘤细胞。 然后将所有细胞置于只允许杂交瘤生长的选择性培养基中；未融合的骨髓瘤细胞无法生长，任何未融合的B细胞都会死亡。 杂交瘤能够在培养物中持续生长，同时产生抗体，然后筛选出所需的单克隆抗体。 产生所需单克隆抗体的人在组织培养中生长；培养基定期收获，并从培养基中纯化单克隆抗体。 这是一个非常昂贵且耗时的过程。 可能需要数周的培养和数升的培养基才能为实验或治疗单个患者提供足够的单克隆抗体。单克隆抗体价格昂贵（图\(\PageIndex{3}\)）。

图\(\PageIndex{3}\)：单克隆抗体（mAb）是通过向小鼠引入抗原，然后将小鼠脾脏中的多克隆 B 细胞融合到骨髓瘤细胞中而产生的。 由此产生的杂交瘤细胞被培养并继续产生抗原的抗体。 然后在选择性培养基上大量生长产生所需单克隆抗体的杂交瘤，该培养基定期收获以获得所需的单克隆抗体。

表\(\PageIndex{1}\)：多克隆和单克隆抗体的特征

单克隆抗体	多克隆抗体
昂贵的制作	生产成本低廉
制作时间长	快速生产
大量特异性抗体	大量的非特异性抗体
识别抗原上的单个表位	识别抗原上的多个表位
杂交瘤一旦产生，生产就会连续且均匀	不同批次的成分各不相同

单克隆抗体的临床用途

由于生产单克隆抗体的最常用方法是使用小鼠细胞，因此必须创建人源化单克隆抗体以供人类临床使用。 小鼠抗体不能反复注射到人体内，因为免疫系统会将它们识别为外来的，并会用中和抗体对它们作出反应。 通过对小鼠 B 细胞中的抗体进行基因工程可以最大限度地减少这个问题。 小鼠轻链和重链基因的可变区域与人类恒定区域结合，然后将嵌合基因转移到宿主细胞中。 这允许产生主要是 “人类” 的单克隆抗体，只有抗原结合位点来自小鼠。

人源化单克隆抗体已成功用于治疗癌症，副作用最小。 例如，人源化单克隆抗体药物赫赛汀有助于治疗某些类型的乳腺癌。 还有一些用于治疗传染病的人源化单克隆抗体的初步试验，但这些治疗方法目前均未使用。 在某些情况下，单克隆抗体已被证明过于特异性无法治疗传染病，因为它们识别病原体的某些血清而无法识别其他血清体。 使用靶向不同病原体菌株的多个单克隆抗体的混合物可以解决这个问题。 但是，与单克隆抗体生产相关的巨额成本是另一个挑战，它阻碍了单克隆抗体在治疗微生物感染方面变得切实可行。 ¹

廉价单抗体的一种很有前途的技术是使用基因工程植物生产抗体（或抗体）。 这项技术将植物细胞转化为抗体工厂，而不是依赖组织培养细胞，后者既昂贵又技术要求很高。 在某些情况下，甚至可以通过让患者吃植物而不是通过提取和注射抗体来传递这些抗体。 例如，2013年，一个研究小组将抗体基因克隆到植物中，这些植物能够中和可能导致严重胃肠道疾病的细菌中的重要毒素。 ² 吃这些植物有可能将抗体直接传递给毒素。

练习\(\PageIndex{4}\)

1. 人源化单克隆抗体是如何产生的？
2. 单克隆抗体的 “单克隆” 是什么意思？

使用单克隆抗体对抗埃博拉

在2014-2015年西非埃博拉疫情期间，一些感染埃博拉的患者接受了ZmApp的治疗，这种药物在几个月前对恒河猴进行的试验中被证明是有效的。 ³ zmApp 是通过使用病毒载体将抗体基因纳入烟草植物而产生的三种单克隆抗体的组合。 通过使用三种单克隆抗体，该药物对多种病毒株有效。 不幸的是，只有足够的 zmApp 来治疗少数患者。

尽管当前的技术不足以生产大量 zmApp，但它确实表明，植物抗体（植物生产的单克隆抗体）可用于临床用途，可能具有成本效益，值得进一步开发。 在过去几年中，用于治疗癌症和传染病的基于单克隆抗的新药物数量激增；但是，此类药物的广泛使用目前受到其高昂成本的抑制，尤其是在世界欠发达地区，那里的单剂药价格可能更高比病人一生的收入还要多 开发将抗体基因克隆到植物中的方法可以显著降低成本。

关键概念和摘要

• 抗体与用于挑战免疫系统的抗原具有高特异性结合，但它们也可能通过与与原始抗原具有相同化学特性的其他抗原结合表现出交叉反应性。
• 向动物注射抗原会产生多克隆抗体反应，在这种反应中，会产生不同的抗体，这些抗体与抗原上的各种表位发生反应。
• 多克隆抗血清可用于某些类型的实验室检测，但其他测定需要更高的特异性。 使用多克隆抗血清的诊断测试通常仅用于筛查，因为可能出现假阳性和假阴性结果。
• 单克隆抗体比多克隆抗血清具有更高的特异性，因为它们与单个表位结合并且通常具有很高的亲和力。
• 单克隆抗体通常是通过培养源自小鼠的分泌抗体的杂交瘤而产生的。单克隆抗体目前用于治疗癌症，但其高昂的成本使它们无法被更广泛地用于治疗传染病。 尽管如此，它们在实验室和临床上的应用潜力仍在推动新的、具有成本效益的解决方案的开发，例如抗体。

脚注

1. 1 Saylor、Carolyn、Ekaterina Dadachova 和 Arturo Casadevall，“基于单克隆抗体的微生物疾病疗法”，疫苗 27（2009）：G38-G46。
2. 2 Nakanishi、Katsuhiro 等人，“生产对志贺毒素 1 具有中和活性的杂交 Igg/IgA 抗体”，P loS On e 8，第 11 期（2013）：e80712。
3. 3 Qiu、Xiangguo 等人，“使用 zmApp 逆转非人类灵长类动物的晚期埃博拉病毒病”，《自然 514》（2014）：47—53。