12.1: 微生物和基因工程工具

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学习目标

识别源自微生物的分子遗传学工具
描述用于创建重组 DNA 分子的方法
描述用于将 DNA 引入原核细胞的方法
列出基因组库的类型并描述其用途
描述用于将 DNA 引入真核细胞的方法

临床重点：第 1 部分

凯拉是一位24岁的电气工程师和跑步爱好者，刚从亚利桑那州搬到新罕布什尔州去找一份新工作。在周末休息时，她喜欢探索新的环境，在松树林里长跑。 7月，她花了一个星期的时间徒步穿越群山。 8 月初，Kayla 出现了低烧、头痛和轻度肌肉酸痛，感觉有点疲劳。没想太多，她服用了一些布洛芬来对抗自己的症状，并发誓要多休息。

练习\(\PageIndex{1}\)

哪些类型的医疗状况可能是凯拉的症状造成的？

利用生命系统造福人类的科学被称为生物技术。从技术上讲，通过耕作和育种方法驯化动植物是一种生物技术。但是，从当代的意义上讲，我们将生物技术与生物体遗传学的直接改变联系起来，以通过基因工程过程获得理想的特征。基因工程涉及使用重组 DNA 技术，即在体外操纵 DNA 序列的过程，从而产生具有新遗传物质组合的重组 DNA 分子。然后将重组 DNA 引入宿主生物体中。如果引入的DNA来自不同的物种，则宿主生物现在被认为是转基因的。

转基因微生物的一个例子是产生人胰岛素的细菌菌株（图\(\PageIndex{1}\)）。来自人类的胰岛素基因被插入质粒中。然后将这种重组 DNA 质粒插入细菌中。因此，这些转基因微生物能够产生和分泌人胰岛素。许多原核生物能够通过与其他细胞 “交配”（偶联）、病毒感染（转导）和从环境中吸收DNA（转化）来获得外源DNA并将功能基因纳入自己的基因组。回想一下，这些机制是水平基因转移的例子，即遗传物质在同一代细胞之间的转移。

解释重组 DNA 技术的示意图。胰岛素基因从人体细胞核的 DNA 中移除。然后将该基因插入质粒（一块圆的 DNA）中。结果是重组质粒被插入到细菌细胞中。由此产生的转基因细菌是一种细菌细胞，其质粒含有胰岛素基因。重组细菌分裂并产生由插入的基因编码的蛋白质。在这个例子中，细菌正在产生和分泌胰岛素。结果是溶液中有胰岛素。 — 图\(\PageIndex{1}\)：重组 DNA 技术是人工重组来自两种生物的 DNA。在这个例子中，人类胰岛素基因被插入到细菌质粒中。然后，这种重组质粒可用于转化细菌，从而获得产生胰岛素蛋白的能力。

分子克隆

赫伯特·博耶（Herbert Boyer）和斯坦利·科恩（Stanley Cohen）于1973年首次展示了完整的分子克隆过程，当时他们成功地将来自非洲爪蛙（Xenopus laevis）的基因克隆成细菌质粒，然后将其引入细菌宿主大肠杆菌。分子克隆是一套用于构建重组 DNA 并将其整合到宿主生物体中的方法；它利用了许多源自微生物的分子工具。

限制酶和连接酶

在重组 DNA 技术中，使用主要来自细菌和病毒的天然酶来操纵 DNA 分子。重组 DNA 分子之所以成为可能，是因为使用了天然存在的限制性内切酶（限制酶），这些细菌酶是作为切割和破坏外来细胞质DNA的保护机制而产生的，而外源细胞质DNA最常见的是噬菌体感染的结果。 Stewart Linn和Werner Arber在1960年代关于大肠杆菌如何限制感染时噬菌体复制的研究中发现了限制酶。今天，我们广泛使用限制酶来切割 DNA 片段，然后这些片段可以拼接到另一个 DNA 分子中形成重组分子。每种限制酶在特征识别位点切割 DNA，这是一种特定的、通常是回文的 DNA 序列，长度通常在四到六个碱基对之间。回文是一系列字母，其向前和向后读取相同。（“level” 一词是回文的一个例子。） Palindromic DNA 序列在一条链上 5 到 3 方向的碱基序列与互补链上在 5到 3方向上的碱基序列相同。限制酶识别 DNA 回文并在回文中的相同位置切割每个骨干。一些限制酶切割以产生具有互补悬垂（粘性末端）的分子，而另一些则在不产生这种悬垂的情况下进行切割，而是产生钝端（图\(\PageIndex{2}\)）。

具有互补粘性末端的分子可以很容易地在其粘性末端退火或在互补碱基之间形成氢键。退火步骤允许对单链悬伸进行杂交。杂交是指两条互补的单链DNA结合在一起。钝端也可以连接在一起，但效率低于粘性末端，因为缺少促进该过程的互补悬伸。无论哪种情况，Ligationby DNA连接酶都可以通过共价键重新连接DNA的两个糖磷酸骨干，从而使该分子成为连续的双链。 1972年，斯坦福大学生物化学家保罗·伯格率先使用这种技术生产重组DNA分子，将SV40猴病毒与大肠杆菌噬菌体lambda结合起来，形成了杂种。

限制酶如何切割 DNA 的示意图。两张图都显示了被切割的双链 DNA 片段。 A) 在粘性末端切割 DNA，这样切割部位就会有短的单链 DNA 片段。在这个例子中，酶切序列 GGATCC；它在两个 G 之间切开。切割后，两条链都有双链 G/C 键，但随后也有单链 GATC。在钝头切割中，没有单绞末端。在这个例子中，酶在 G 和 C 之间切开 GGCC — 图\(\PageIndex{2}\)：(a) 在这个由 *Bam* HI 酶识别的六核苷酸限制酶位点中，注意两条链上该序列在 5 到 3 方向的读数相同。这被称为回文。限制酶在部位（用黑色箭头表示）切割DNA会产生末端粘稠的DNA片段。用相同的限制酶切割的另一块DNA可能会附着在其中一个粘性末端，形成重组的DNA分子。 (b) 该四核苷酸识别位点还显示回文序列。限制酶H a e III在指定位点切割DNA会产生末端钝的DNA片段。任何其他钝的 DNA 片段都可能附着在产生的其中一个钝端上，形成重组 DNA 分子。

质粒

限制性消化后，感兴趣的基因通常会被插入质粒中，质粒通常是圆形的双链 DNA，独立于细菌染色体复制（参见原核细胞的独特特征）。在重组 DNA 技术中，质粒通常用作载体，即将 DNA 片段从一个生物体携带到另一个生物的 DNA 分子。用作载体的质粒可以由研究人员和科学供应公司进行基因改造，使其具有特殊特性，如常用的质粒载体 puc19 所示（图\(\PageIndex{3}\)）。一些质粒载体含有赋予抗生素耐药性的基因；这些耐药基因使研究人员能够通过将其涂在含有相应抗生素的培养基上来轻松找到含有质粒的菌落。抗生素杀死所有不含有所需质粒载体的宿主细胞，但含有该载体的宿主细胞能够存活和生长。

用于克隆的质粒载体通常具有多连接器位点或多克隆位点 (MCS)。 polylinker 位点是一个包含多个独特的限制性酶识别位点的短序列，用于在限制消化 DNA 和质粒后将 DNA 插入质粒中。将这些多限制酶识别位点置于 polylinker 位点使质粒载体用途广泛，因此它可用于涉及不同限制酶的许多不同的克隆实验。

这种多连体位点通常存在于报告基因中，报告基因是另一种人工改造成质粒的基因序列，用于编码可视化DNA插入的蛋白质。报告基因允许研究人员区分含有带有克隆 DNA 片段的重组质粒的宿主细胞和仅含有非重组质粒载体的宿主细胞。质粒载体中最常用的报告基因是编码 β-半乳糖苷酶的细菌 LacZ 基因，这种酶可以自然降解乳糖，但也可以降解无色合成类似物 X-gal，从而在含有 X-Gal 的培养基上产生蓝色菌落。当重组 DNA 拼接到质粒中时，LacZ 报告基因被禁用。由于 LacZ 蛋白在基因被禁用时不会产生，因此 X-gal 不会降解，会产生白色菌落，然后可以将其分离出来。下文将介绍这种蓝白筛选方法，如图所示\(\PageIndex{4}\)。除了这些特征外，一些质粒是预先消化的，并且在插入外来的 DNA 片段后，含有一种与线性化质粒相关的酶，以帮助结扎。

pc19 质粒长 2686 bp，呈圆形。有许多不同长度的箭头围绕圆圈顺时针或逆时针移动。圆圈的最顶部有数字 1，大约在 225 位置（从 1 顺时针移动）是一个包含以下限制酶位点的 plylinker 位点（MC）：HidiII、PSTI、saII、xBai、bamHi、smaI、ecori。 polylinker 网站的开头是 LACZ-alpha。位于 2500 位置并逆时针移动的是 amp 基因。 — 图\(\PageIndex{3}\)：人工构建的质粒载体 puc19 通常用于克隆外来 DNA。箭头表示基因的转录方向。注意在 L *acZ* 报告基因中发现的 polylinker 位点包含多个独特的限制酶识别位点。另请注意质粒上编码的氨苄西林（*amp*）耐药基因。

使用转化进行分子克隆

将工程质粒引入细菌细胞的最常用机制是转化，在这个过程中，细菌从周围环境中吸收游离 DNA。在自然界中，游离DNA通常来自其他裂解的细菌细胞；在实验室中，以重组质粒的形式将游离DNA引入细胞的周围环境。

有些细菌，例如芽孢杆菌属，具有天生能力，这意味着它们能够吸收外来的 DNA。但是，并非所有细菌都具有天然能力。在大多数情况下，必须通过提高细胞膜的渗透性来使细菌在实验室中具有人为能力。这可以通过中和细胞膜上的电荷的化学处理来实现，也可以将细菌暴露在电场中，从而在细胞膜中产生微观孔隙。这些方法分别产生化学合格或电能细菌。

按照转化方案，细菌细胞被镀在含有抗生素的培养基上，以抑制许多未被具有抗生素耐药性的质粒转化的宿主细胞的生长。然后将一种称为蓝白筛选的技术用于 LacZ 编码质粒载体，例如 puc19。蓝色菌落具有功能性 β-半乳糖苷酶，因为 LacZ 基因不间断，没有外来 DNA 插入多连接器位点。这些菌落通常是由消化的、线性化的质粒重现自身产生的。但是，白色菌落缺乏功能性β-半乳糖苷酶，这表明在质粒载体的多连接器位点中插入了外来的 DNA，从而破坏了 LacZ 基因。因此，通过这种蓝白色筛选产生的白色菌落包含带有插入物的质粒，可以进一步筛选以表征外来DNA。为了确保将正确的DNA掺入质粒中，然后可以对DNA插入物进行测序。

链接到学习

在 DNA 学习中心观看分子克隆动画。

练习\(\PageIndex{2}\)

在蓝白筛查中，蓝色菌落是什么意思，为什么是蓝色的？

使用共轭或转导进行分子克隆

细菌偶联过程（参见无性原核生物如何实现遗传多样性）也可以用于分子克隆。 F 质粒或生育质粒通过偶联过程在细菌细胞之间转移。当含有重组 F 质粒的细菌细胞与缺少重组 F 质粒的相容细菌细胞混合时，可以通过偶联转移重组 DNA。 F 质粒编码一种叫做 F pilus 的表面结构，它促进了含有 F 质粒的细胞与没有 F 质粒的细胞之间的接触。接触时，两个细胞之间形成细胞质桥，含有 F 质粒的细胞复制其质粒，将重组 F 质粒的副本转移到受体细胞。一旦接受了重组 F 质粒，受体细胞就可以产生自己的 F pilus 并促进重组 F 质粒转移到另一个细胞。使用偶联将重组 F 质粒转移到受体细胞是将重组 DNA 分子引入宿主细胞的另一种有效方法。

或者，噬菌体可用于通过操纵转导过程将重组DNA引入宿主细菌细胞（参见无性原核生物如何实现遗传多样性）。在实验室中，可以将感兴趣的DNA片段改造成噬菌体，噬菌体是具有噬菌体序列的质粒，可以将其封装成噬菌体。然后可以用这些噬菌体感染细菌细胞，从而将重组噬菌体引入细菌细胞。根据噬菌体的类型，重组DNA可能被整合到宿主细菌基因组（溶菌发育）中，也可能作为质粒存在于宿主的细胞质中。

解释分子克隆的图表。外来的 dNA 和质粒都是用相同的限制酶切割的。限制位点在和酶基因 (LacZ) 中间的质粒中仅出现一次。质粒还含有氨苄青霉素耐药基因。限制酶在外来的 DNA 片段和质粒上留下互补的粘性末端。这允许在粘性末端退火时将外来的 DNA 插入质粒中。添加 DNA 连接酶可重新连接 DNA 骨干。这些是重组质粒。质粒与活细菌培养物结合在一起。许多细菌不会将任何质粒带入细胞。许多人摄取不含外来DNA的质粒，还有一些人吸收了重组质粒。吸收重组质粒的细菌无法从片段插入的基因（LacZ）中产生酶。它们还携带对抗生素氨苄青霉素的耐药基因，氨苄青霉素存在于原始质粒上。为了找到含有重组质粒的细菌，细菌是在含有抗生素氨苄青霉素的盘子上生长，氨苄青霉素是一种在暴露于 LacZ 基因产生的酶时会改变颜色的物质。氨苄青霉素会杀死任何未吸收质粒的细菌。当 LacZ 的基因含有外来 DNA 插入物时，该物质的颜色不会改变。这些是我们想要培育的含有重组质粒的细菌。 — 图\(\PageIndex{4}\)：此图形流程图概述了使用细菌转化进行分子克隆所涉及的步骤。

练习\(\PageIndex{2}\)

限制酶的原始功能是什么？
利用哪两个过程将重组 DNA 转化为细菌宿主细胞？
区分质粒载体中抗生素耐药基因和报告基因的用途。

创建基因组库

分子克隆也可用于生成基因组文库。该文库是生物体基因组的完整（或近乎完整）的拷贝，以重组 DNA 质粒的形式被改造成细菌的独特克隆。拥有这样的库可以让研究人员通过培育每个片段的细菌宿主来创建大量的每个片段。这些片段可用于确定DNA的序列和存在的任何基因的功能。

生成基因组文库的一种方法是将个体限制酶消化的基因组片段连接成用相同限制酶切割的质粒载体（图\(\PageIndex{5}\)）。转化为细菌宿主后，每个转化的细菌细胞吸收单个重组质粒并长成细胞群。该菌落中的所有细胞都是相同的克隆，携带相同的重组质粒。由此产生的文库是菌落的集合，每个菌落都包含原始生物体基因组的片段，每个菌落都是独立且不同的，每个菌落都可用于进一步研究。这使得研究人员有可能筛选这些不同的克隆，以发现含有原始生物基因组中感兴趣基因的克隆。

显示基因组库生成的示意图。该图首先从生物体（在本例中为蠕虫）中提取DNA并切成碎片。然后将每个 DNA 片段插入不同的质粒中。这会产生许多片段，每个片段都有与基因组不同的插入物。然后用这些载体对细菌进行转化。每种细菌都会复制产生克隆菌落，每个克隆菌落都包含来自原始生物的单个DNA片段。 — 图\(\PageIndex{5}\)：基因组文库的生成有助于发现含有感兴趣基因的基因组 DNA 片段。（来源 “micrograph”：美国国立卫生研究院对作品的修改）

要使用较大的基因组DNA片段构建基因组文库，可以使用诸如lambda之类的大肠杆菌噬菌体作为宿主（图\(\PageIndex{6}\)）。基因组DNA可以被剪切或酶消化并连接成预先消化的噬菌体lambda DNA载体。然后，这些重组噬菌体DNA分子可以封装成噬菌体颗粒，用于感染板上的大肠杆菌宿主细胞。在每个细胞内感染期间，每个重组噬菌体将自身复制多份并裂解大肠杆菌草坪，形成斑块。因此，噬菌体库中的每个斑块代表一个包含不同基因组DNA片段的独特重组噬菌体。然后可以进一步筛选斑块以寻找感兴趣的基因。使用噬菌体代替质粒生成文库的一个优势是，与质粒载体相比，噬菌体颗粒所含的外来DNA要多得多，因此需要少得多的培养物才能完全代表原始生物体的整个基因组。

显示噬菌体库生成过程的示意图。细胞基因组和噬菌体基因组使用相同的限制酶消化。细胞 DNA 片段内置在重组噬菌体颗粒中（每个颗粒包含不同的细胞 DNA 片段）。然后，大肠杆菌被重组噬菌体感染。细菌草坪中的每块斑块都含有噬菌体，其中包含来自原始基因组的独特片段。 — 图\(\PageIndex{6}\)：重组噬菌体DNA分子是通过将消化的噬菌体颗粒与片段的基因组DNA分子结合而成的。这些重组噬菌体 DNA 分子被包装成噬菌体颗粒，允许其感染细菌草坪。每个斑块代表一个独特的重组 DNA 分子，可以进一步筛选感兴趣的基因。

为了关注生物体甚至组织中表达的基因，研究人员使用该生物体的信使RNA（mRNA）而不是其基因组DNA来构建文库。虽然单个生物体中的所有细胞都将具有相同的基因组DNA，但不同的组织表达不同的基因，产生不同的mRNA补体。例如，所有人类细胞的基因组DNA都含有胰岛素基因，但只有胰腺中的细胞表达指导胰岛素产生的mRNA。由于无法直接克隆 mRNA，因此在实验室中，逆转录酶逆转录酶必须使用 mRNA 作为模板来制造互补 DNA（cDNA）。细胞的全部mRNA补体可以反向转录为cDNA分子，cDNA分子可用作DNA聚合酶的模板以制作双链DNA拷贝；这些片段随后可以结扎到质粒载体或噬菌体中以产生cDNA文库。 cDNA 文库的好处是它仅包含来自细胞中表达基因的 DNA。这意味着文库中没有内含子、启动子等对照序列和注定要转化为蛋白质的DNA。对翻译序列的关注意味着该文库不能用于研究整个基因组的序列和结构。 cDNA 基因组文库的构造如图所示\(\PageIndex{7}\)。

该图显示了 cDNA 文库的生成过程。该图以从生物体（在本例中为蠕虫）中提取的RNA开始。然后使用逆转录将RNA转化为cDNA，然后将每个cDNA片段插入不同的质粒中。这会产生许多片段，每个片段都有与基因组不同的插入物。然后用这些载体对细菌进行转化。每种细菌都会复制产生克隆菌落，每个克隆菌落都包含来自原始生物的单个cDNA片段。 — 图\(\PageIndex{7}\)：互补DNA（cDNA）由逆转录病毒酶逆转录酶由mRNA制成，转化为双链拷贝，然后插入质粒载体或噬菌体中，产生cDNA文库。（来源 “micrograph”：美国国立卫生研究院对作品的修改）

练习\(\PageIndex{3}\)

描述的基因组库的主机有哪些？
什么是 cDNA？

将重组分子引入真核宿主

使用细菌宿主进行基因工程为重组DNA技术奠定了基础；但是，研究人员也对基因工程真核细胞，尤其是动植物的真核细胞产生了浓厚的兴趣。将重组 DNA 分子引入真核生物宿主称为转染。转基因植物，称为转基因植物，在农业和制药方面具有重大意义。第一个商业销售的转基因植物是Flavr Savr延迟成熟番茄，它于1994年上市。还成功生产了经过基因改造的牲畜，例如，猪的营养价值增加 ¹，山羊在牛奶中分泌药品。 ²

电穿孔

与细菌细胞相比，真核细胞往往不太适合作为重组 DNA 分子的宿主。由于真核生物通常既没有能力吸收外来的 DNA，也无法维持质粒，因此转染真核生物宿主的挑战性要大得多，需要更具侵入性的技术才能取得成功。一种用于在细胞培养物中转染细胞的方法称为电穿孔。短暂的电脉冲诱导细胞磷脂双层中形成短暂的孔隙，通过这些孔隙可以引入基因。同时，电脉冲在细胞内部的一侧产生短暂的正电荷，另一侧产生负电荷；电荷差将带负电荷的 DNA 分子吸入细胞（图\(\PageIndex{8}\)）。

显微注射

另一种转染方法称为显微注射。由于真核细胞通常比原核细胞大，因此有时可以使用玻璃微量移液器将 DNA 片段直接注射到细胞质中，如图所示\(\PageIndex{9}\)。

基因枪

转染植物细胞可能比动物细胞更困难，因为它们的细胞壁很厚。一种方法是用酶处理植物细胞以去除其细胞壁，从而产生原生质体。然后，使用基因枪将涂有重组 DNA 分子的金或钨颗粒高速射入植物原生质体。然后，受体原生质体细胞可以恢复并用于生成新的转基因植物（图\(\PageIndex{10}\)）。

航天飞机向量

另一种转染植物的方法涉及穿梭载体，即可以在细菌和真核细胞之间移动的质粒。源自 Agrobacterium tumefaciens 细菌的诱导肿瘤（T _i）质粒通常用作将基因融入植物的穿梭载体（图\(\PageIndex{11}\)）。在自然界中，A. tumefaciens 的 T _i 质粒在植物从细菌细胞转移到植物细胞时会导致植物出现肿瘤。研究人员已经能够操纵这些天然存在的质粒来去除其致肿瘤基因并插入理想的DNA片段。由此产生的重组 T _i 质粒可以通过 T _i 质粒从细菌自然转移到植物宿主转移到植物基因组中。一旦进入植物宿主细胞，感兴趣的基因就会重组到植物细胞的基因组中。

使用钛质粒转化植物细胞的示意图。标有 Agrobacterium tumefaciens 的棒状细胞的显微照片。质粒是从这些细胞中分离出来的。质粒（Ti 质粒）具有标记为 T-DNA 区域的区域。来自细胞 DNA 的感兴趣基因被插入到 T-DNA 区域。转化后的重组 DNA 会返回到 A. tumefaciens 身上。然后，细菌会感染植物细胞。这会插入感兴趣的基因并产生重组植物。 — 图\(\PageIndex{11}\)：*Agrobacterium tumefaciens* 的 T _i 质粒是植物细胞吸收感兴趣基因的有用穿梭载体。感兴趣的基因被克隆到 T _i 质粒中，然后将其引入植物细胞。然后，感兴趣的基因重组到植物细胞的基因组中，从而可以产生转基因植物。

病毒载体

病毒载体也可用于转染真核细胞。实际上，这种方法通常用于基因疗法（参见基因疗法），将健康基因引入患有基因突变引起的疾病的人类患者。病毒基因可以被删除并替换为要传递给患者的基因；³ 然后，病毒感染宿主细胞，并将外来的 DNA 输送到靶向细胞的基因组中。腺病毒通常用于此目的，因为它们可以生长到高滴度，并且可以感染未分裂和分裂的宿主细胞。但是，如基因疗法中所述，使用病毒载体进行基因治疗可能会给患者带来一些风险。

练习\(\PageIndex{4}\)

将重组DNA载体引入动物细胞的方法有哪些？
比较和对比穿梭载体和病毒载体。

关键概念和摘要

生物技术是一门利用生命系统造福人类的科学。近年来，由于重组 DNA 技术的进步，通过基因工程直接改变生物体基因组的能力之所以成为可能，该技术使研究人员能够使用新的组合创造重组 DNA 分子遗传物质。
分子克隆涉及用于构建重组 DNA 和促进其在宿主生物体中复制的方法。这些方法包括使用限制酶（切割外来的 DNA 和质粒载体）、结扎（将 DNA 片段粘贴在一起）以及将重组 DNA 引入宿主生物（通常是细菌）。
蓝白筛选允许使用报告基因的表型来选择含有重组质粒的细菌转化体，该报告基因因插入 DNA 片段而失效。
基因组文库可以通过将来自一个生物体的基因组片段克隆到质粒载体或噬菌体中来构建。
可以生成 cDNA 文库来表示给定点在细胞中表达的 mRNA 分子。
真核宿主的@@ 转染可以通过使用电穿孔、基因枪、微量注射、穿梭载体和病毒载体的各种方法来实现。

脚注

1 赖良雪、康静 X、李荣峰、王敬东、William T. Witt、Hwan Yul Yong、郝艳红等。 “生成富含欧米伽-3脂肪酸的克隆转基因猪。” 《自然生物技术》第 24 期第 4 期（2006）：435—436。
2 雷琳·拉莫斯·莫拉、露西亚娜·马加良斯·梅洛和维森特·何塞·德·菲盖雷多·弗雷塔斯。 “在转基因和非转基因山羊的牛奶中产生重组蛋白。” 巴西生物与技术档案馆 54 第 5 期（2011）：927—938。
3 William S.M. Wold 和 Karoly Toth。 “用于基因疗法、疫苗接种和癌症基因疗法的腺病毒载体。” 《当前基因疗法》第 13 期第 6 期（2013）：421。