Skip to main content
Global

7.5: استخدام الكيمياء الحيوية لتحديد الكائنات الحية الدقيقة

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    194969

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    أهداف التعلم

    • وصف أمثلة لمنتجات التخليق الحيوي داخل الخلية التي يمكن اكتشافها لتحديد البكتيريا

    يعد التحديد الدقيق للعزلات البكتيرية أمرًا ضروريًا في مختبر الأحياء الدقيقة السريرية لأن النتائج غالبًا ما تفيد القرارات المتعلقة بالعلاج الذي يؤثر بشكل مباشر على نتائج المرضى. على سبيل المثال، تتطلب حالات التسمم الغذائي تحديدًا دقيقًا للعامل المسبب حتى يتمكن الأطباء من وصف العلاج المناسب. وبالمثل، من المهم تحديد العامل الممرض المسبب بدقة أثناء تفشي المرض حتى يمكن استخدام الاستراتيجيات المناسبة لاحتواء الوباء.

    هناك العديد من الطرق لاكتشاف الكائنات الحية الدقيقة وتوصيفها وتحديدها. تعتمد بعض الطرق على الخصائص البيوكيميائية المظهرية، بينما تستخدم طرق أخرى تحديد النمط الجيني. توفر الخصائص البيوكيميائية للبكتيريا العديد من السمات المفيدة للتصنيف والتعرف. يعد تحليل القدرات الغذائية والتمثيل الغذائي للعزل البكتيري نهجًا شائعًا لتحديد جنس وأنواع البكتيريا. ستتم مناقشة بعض أهم مسارات التمثيل الغذائي التي تستخدمها البكتيريا للبقاء على قيد الحياة في الأيض الميكروبي. في هذا القسم، سنناقش بعض الطرق التي تستخدم الخصائص البيوكيميائية لتحديد الكائنات الحية الدقيقة.

    تقوم بعض الكائنات الحية الدقيقة بتخزين مركبات معينة كحبيبات داخل السيتوبلازم، ويمكن استخدام محتويات هذه الحبيبات لأغراض التعريف. على سبيل المثال، يعتبر بولي بيتا هيدروكسي بوتيرات (PHB) مركبًا لتخزين الكربون والطاقة يوجد في بعض البكتيريا غير الفلورية من جنس Pseudomonas. يمكن تصنيف الأنواع المختلفة داخل هذا الجنس من خلال وجود أو عدم وجود PHB والأصباغ الفلورية. يعد العامل الممرض البشري P. aeruginosa وممرض النبات P. singae مثالين على أنواع Pseudomonas الفلورية التي لا تتراكم فيها حبيبات PHB.

    تعتمد الأنظمة الأخرى على الخصائص البيوكيميائية لتحديد الكائنات الحية الدقيقة من خلال تفاعلاتها البيوكيميائية، مثل استخدام الكربون واختبارات التمثيل الغذائي الأخرى. في البيئات المختبرية الصغيرة أو في المختبرات التعليمية، يتم إجراء هذه الاختبارات باستخدام عدد محدود من أنابيب الاختبار. ومع ذلك، فإن الأنظمة الأكثر حداثة، مثل تلك التي طورتها شركة Biolog، Inc.، تعتمد على لوحات من التفاعلات البيوكيميائية التي يتم إجراؤها في وقت واحد وتحليلها بواسطة البرامج. يحدد نظام Biolog الخلايا بناءً على قدرتها على استقلاب بعض المواد الكيميائية الحيوية وعلى خصائصها الفسيولوجية، بما في ذلك درجة الحموضة والحساسية الكيميائية. يستخدم جميع الفئات الرئيسية من المواد الكيميائية الحيوية في تحليله. يمكن إجراء عمليات التعريف يدويًا أو باستخدام الأدوات شبه الآلية أو الآلية بالكامل.

    يقوم نظام آلي آخر بتحديد الكائنات الحية الدقيقة من خلال تحديد الطيف الكتلي للعينة ثم مقارنتها بقاعدة بيانات تحتوي على أطياف الكتلة المعروفة لآلاف الكائنات الحية الدقيقة. تعتمد هذه الطريقة على قياس الطيف الكتلي للتلخيص/التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-TOF) وتستخدم ألواح MALDI التي يمكن التخلص منها والتي يتم خلط الكائنات الحية الدقيقة عليها مع كاشف مصفوفة متخصص (الشكل\(\PageIndex{1}\)). يتم تشعيع خليط العينة/الكاشف باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية النبضي عالي الكثافة، مما يؤدي إلى طرد الأيونات الغازية المتولدة من المكونات الكيميائية المختلفة للكائنات الحية الدقيقة. يتم جمع هذه الأيونات الغازية وتسريعها من خلال مطياف الكتلة، حيث تنتقل الأيونات بسرعة تحددها نسبة الكتلة إلى الشحنة (m/z)، وبالتالي تصل إلى الكاشف في أوقات مختلفة. ينتج عن مخطط إشارة الكاشف مقابل m/z طيفًا كتلًا للكائن الحي يرتبط بشكل فريد بتكوينه البيوكيميائي. تسمح مقارنة الطيف الكتلي بمكتبة الأطياف المرجعية التي تم الحصول عليها من التحليلات المتطابقة للكائنات الحية الدقيقة المعروفة بتحديد الميكروب غير المعروف.

    مخطط انسيابي. يُطلق على لوحة مربعة بها شبكة من الدوائر اسم الكائنات الحية الدقيقة النامية على لوحة مالدي. ثم قم بتشعيع العينة. ثم استخدم مطياف الكتلة لقياس الأيونات الغازية المنبعثة. ثم قارن الطيف الكتلي للعينة بالأطياف المرجعية؛ يظهر رسمان بيانيان صغيران هنا. ثم تم تحديد الأنواع.
    الشكل\(\PageIndex{1}\): تُستخدم طرق MALDI-TOF الآن بشكل روتيني لإجراءات التشخيص في مختبرات الأحياء الدقيقة السريرية. هذه التقنية قادرة على التعرف بسرعة على بعض الكائنات الحية الدقيقة التي لا يمكن التعرف عليها بسهولة بالطرق التقليدية. (صورة لوحة MALDI: تعديل العمل بقلم تشين كيو وليو تي وتشين جي؛ «الرسوم البيانية» الائتمانية: تعديل عمل بيلز جيه، فيدال إل، إيفانوف دي إيه، سولوفييف إم)

    يمكن أيضًا تحديد الميكروبات من خلال قياس ملامح الدهون الفريدة الخاصة بها. كما تعلمنا، يمكن أن تختلف الأحماض الدهنية للدهون في طول السلسلة، ووجود أو عدم وجود روابط مزدوجة، وعدد الروابط المزدوجة ومجموعات الهيدروكسيل والفروع والحلقات. لتحديد الميكروب من خلال تركيبته الدهنية، يتم تحليل الأحماض الدهنية الموجودة في أغشيته. التحليل البيوكيميائي الشائع المستخدم لهذا الغرض هو تقنية تستخدم في المختبرات السريرية والصحة العامة والأغذية. يعتمد على اكتشاف الاختلافات الفريدة في الأحماض الدهنية ويسمى تحليل ميثيل الأحماض الدهنية (FAME). في تحليل FAME، يتم استخراج الأحماض الدهنية من أغشية الكائنات الحية الدقيقة، ويتم تغييرها كيميائيًا لتشكيل استرات الميثيل المتطايرة، ويتم تحليلها بواسطة كروماتوغرافيا الغاز (GC). تتم مقارنة كروماتوجرام GC الناتج مع الكروماتوجرامات المرجعية في قاعدة بيانات تحتوي على بيانات لآلاف العزلات البكتيرية لتحديد الكائنات الحية الدقيقة غير المعروفة (الشكل\(\PageIndex{2}\)).

    مخطط انسيابي. تنمو ثقافة بكتيرية (الصورة عبارة عن لوحة أجار). ثم يتم استخراج الأحماض الدهنية وتحويلها إلى استرات الميثيل (الصورة لأنبوب اختبار). ثم يحلل كروماتوغرافيا الغاز بصمات ميثيل إستر (الصورة لآلة كروماتوغرافيا). ثم يتم تحديد البكتيريا (الصورة عبارة عن رسم بياني). يمثل المحور X للرسم البياني وقت الاحتفاظ بالعمود. المحور Y هو إشارة الكاشف. يحتوي الخط على قمم مختلفة.
    الشكل\(\PageIndex{2}\): يؤدي تحليل إستر ميثيل الأحماض الدهنية (FAME) في تحديد البكتيريا إلى رسم كروماتوجرافي فريد لكل بكتيريا. تتوافق كل ذروة في كروماتوجرام الغاز مع إستر ميثيل الأحماض الدهنية المحدد وارتفاعه يتناسب مع الكمية الموجودة في الخلية. («ثقافة» الائتمان: تعديل العمل من قبل مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها؛ «الرسم البياني» الائتماني: تعديل العمل من قبل Zhang P. و Liu P.)

    هناك طريقة ذات صلة لتحديد الكائنات الحية الدقيقة تسمى تحليل الأحماض الدهنية المشتقة من الفوسفوليبيد (PLFA). تتكون الأغشية في الغالب من الفسفوليبيدات، والتي يمكن تصبينها (تحللها بالماء بالقلويات) لإطلاق الأحماض الدهنية. ثم يتم إخضاع خليط الأحماض الدهنية الناتج لتحليل FAME، ويمكن مقارنة ملامح الدهون المقاسة مع تلك الخاصة بالكائنات الحية الدقيقة المعروفة لتحديد الكائنات الحية الدقيقة غير المعروفة.

    يمكن أن يعتمد تحديد البكتيريا أيضًا على البروتينات المنتجة في ظل ظروف نمو محددة داخل جسم الإنسان. تسمى هذه الأنواع من إجراءات تحديد الهوية بالتحليل البروتيني. لإجراء التحليل البروتيني، يتم فصل البروتينات من العامل الممرض أولاً عن طريق كروماتوغرافيا سائلة عالية الضغط (HPLC)، ثم يتم هضم الأجزاء المجمعة لإنتاج شظايا ببتيد أصغر. يتم تحديد هذه الببتيدات من خلال قياس الطيف الكتلي ومقارنتها مع تلك الخاصة بالكائنات الحية الدقيقة المعروفة لتحديد الكائنات الحية الدقيقة غير المعروفة في العينة الأصلية.

    يمكن أيضًا التعرف على الكائنات الحية الدقيقة من خلال الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات (البروتينات السكرية) في غشاء البلازما أو جدار الخلية. يمكن أن تلتصق الأجسام المضادة والبروتينات الأخرى المرتبطة بالكربوهيدرات بكربوهيدرات معينة على أسطح الخلايا، مما يتسبب في تكتل الخلايا معًا. يتم إجراء الاختبارات المصلية (على سبيل المثال، اختبارات مجموعات Lancefield، والتي تستخدم لتحديد أنواع Streptococcus) للكشف عن الكربوهيدرات الفريدة الموجودة على سطح الخلية.

    التركيز السريري: القرار

    توقفت بيني عن استخدام واقي الشمس الجديد ووضعت كريم الكورتيكوستيرويد على الطفح الجلدي حسب التوجيهات. ومع ذلك، بعد عدة أيام، لم يتحسن الطفح الجلدي ويبدو أنه يزداد سوءًا. حددت موعدًا للمتابعة مع طبيبها، الذي لاحظ وجود طفح جلدي أحمر وعر وبثور مليئة بالقيح حول بصيلات الشعر (الشكل\(\PageIndex{3}\)). كان الطفح الجلدي يتركز بشكل خاص في المناطق التي كان من الممكن تغطيتها بملابس السباحة. بعد بعض الاستجواب، أخبرت بيني الطبيب أنها حضرت مؤخرًا حفلة على حمام السباحة وأمضت بعض الوقت في حوض استحمام ساخن. في ضوء هذه المعلومات الجديدة، اشتبه الطبيب في وجود حالة طفح جلدي في حوض الاستحمام الساخن، وهي عدوى تسببها في كثير من الأحيان بكتيريا Pseudomonas aeruginosa، وهي من مسببات الأمراض الانتهازية التي يمكن أن تزدهر في أحواض الاستحمام الساخنة وحمامات السباحة، خاصة عندما لا تكون المياه مكلورة بشكل كافٍ. P. aeruginosa هي نفس البكتيريا المرتبطة بالتهابات في رئتي مرضى التليف الكيسي.

    جلد ذو نتوءات حمراء مرتفعة.
    الشكل\(\PageIndex{3}\): يمكن أن يتسبب التعرض لـ Pseudomonas aeruginosa في مياه حمام السباحة أو حوض الاستحمام الساخن أحيانًا في حدوث عدوى جلدية تظهر على شكل «طفح حوض الاستحمام الساخن». (مصدر: تعديل العمل من قبل «Lsupellmel» /ويكيميديا كومنز)

    قام الطبيب بجمع عينة من طفح بيني لإرسالها إلى مختبر الأحياء الدقيقة السريرية. تم إجراء اختبارات تأكيدية لتمييز P. aeruginosa عن مسببات الأمراض المعوية التي يمكن أن تكون موجودة أيضًا في مياه حمام السباحة وحوض الاستحمام الساخن. وشمل الاختبار إنتاج صبغة البيوسيانين ذات اللون الأزرق والأخضر على السيتريميد أجار والنمو عند 42 درجة مئوية، وهو عامل انتقائي يمنع نمو الأنواع الأخرى من النباتات الميكروبية ويعزز أيضًا إنتاج أصباغ P. aeruginosa pyocyanin و fluorescein، وهما اللون الأزرق والأخضر المميز والأصفر والأخضر، على التوالي.

    أكدت الاختبارات وجود P. aeruginosa في عينة جلد بيني، لكن الطبيب قرر عدم وصف مضاد حيوي. على الرغم من أن P. aeruginosa هي بكتيريا، إلا أن أنواع Pseudomonas تقاوم عمومًا العديد من المضادات الحيوية. لحسن الحظ، عادةً ما تكون الالتهابات الجلدية مثل عدوى بيني محدودة ذاتيًا؛ وعادة ما يستمر الطفح الجلدي حوالي أسبوعين ويختفي من تلقاء نفسه، مع أو بدون علاج طبي. نصح الطبيب بيني بالانتظار والاستمرار في استخدام كريم الكورتيكوستيرويد. لن يقتل الكريم P. aeruginosa على جلد بيني، ولكن يجب أن يهدئ الطفح الجلدي ويقلل من الحكة عن طريق قمع استجابة جسدها الالتهابية للبكتيريا.

    المفاهيم الأساسية والملخص

    • يعد التحديد الدقيق للبكتيريا أمرًا ضروريًا في المختبر السريري لتشخيص وإدارة الأوبئة والأوبئة والتسمم الغذائي الناجم عن تفشي البكتيريا.
    • يتضمن تحديد النمط الظاهري للكائنات الحية الدقيقة استخدام الصفات التي يمكن ملاحظتها، بما في ذلك ملامح المكونات الهيكلية مثل الدهون، ومنتجات التخليق الحيوي مثل السكريات أو الأحماض الأمينية، أو مركبات التخزين مثل بولي بيتا هيدروكسي بوتيرات.
    • يمكن التعرف على ميكروب غير معروف من الطيف الكتلي الفريد الناتج عندما يتم تحليله بواسطة زمن الامتزاز الليزر/التأين بمساعدة المصفوفة لقياس طيف كتلة الطيران (MALDI-TOF).
    • يمكن تحديد الميكروبات من خلال تحديد تركيباتها الدهنية، باستخدام استرات ميثيل الأحماض الدهنية (FAME) أو تحليل الأحماض الدهنية المشتقة من الفوسفوليبيد (PLFA).
    • يمكن أيضًا استخدام التحليل البروتيني، وهو دراسة جميع البروتينات المتراكمة للكائن الحي، لتحديد البكتيريا.
    • يمكن أن ترتبط البروتينات السكرية في غشاء البلازما أو هياكل جدار الخلية بالليكتين أو الأجسام المضادة ويمكن استخدامها لتحديد الهوية.