2.3: أدوات الفحص المجهري
- Page ID
- 195011
أهداف التعلم
- تحديد ووصف أجزاء مجهر برايتفيلد
- احسب التكبير الكلي لمجهر مركب
- وصف السمات المميزة والاستخدامات النموذجية لأنواع مختلفة من المجاهر الضوئية والمجاهر الإلكترونية ومجهر مسبار المسح
فتح الرواد الأوائل للفحص المجهري نافذة على العالم غير المرئي للكائنات الحية الدقيقة. لكن الفحص المجهري استمر في التقدم في القرون التي تلت ذلك. في عام 1830، ابتكر جوزيف جاكسون ليستر مجهرًا ضوئيًا حديثًا بشكل أساسي. شهد القرن العشرين تطور المجاهر التي استفادت من الضوء غير المرئي، مثل الفحص المجهري الفلوري، الذي يستخدم مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية، والمجهر الإلكتروني، الذي يستخدم الحزم الإلكترونية ذات الطول الموجي القصير. أدت هذه التطورات إلى تحسينات كبيرة في التكبير والدقة والتباين. وبالمقارنة، كانت المجاهر البدائية نسبيًا لفان ليوينهوك ومعاصريه أقل قوة بكثير حتى من المجاهر الأساسية المستخدمة اليوم. في هذا القسم، سنقوم بمسح مجموعة واسعة من التقنيات المجهرية الحديثة والتطبيقات الشائعة لكل نوع من أنواع الميكروسكوب.
الفحص المجهري الضوئي
تندرج العديد من أنواع المجاهر تحت فئة مجاهر الضوء، التي تستخدم الضوء لتصور الصور. تشمل أمثلة مجاهر الضوء مجاهر المجال الساطع، ومجهر الحقل المظلم، ومجهر التباين الطوري، ومجهر تباين التداخل التفاضلي، والمجاهر الفلورية، ومجهر الليزر للمسح البؤري، والمجاهر الليزرية ذات الفوتون الثنائي. يمكن استخدام هذه الأنواع المختلفة من مجاهر الضوء لتكمل بعضها البعض في التشخيص والبحث.
مجاهر برايتفيلد
مجهر Brightfield، ربما يكون أكثر أنواع الميكروسكوب استخدامًا، هو مجهر مركب مع عدستين أو أكثر تنتج صورة داكنة على خلفية مشرقة. بعض مجاهر المجال الساطع أحادية العين (ذات عدسة واحدة)، على الرغم من أن معظم مجاهر المجال الساطع الأحدث هي مجهرية ثنائية العين (تحتوي على عدستين)، مثل تلك الموضحة في الشكل\(\PageIndex{1}\)؛ في كلتا الحالتين، تحتوي كل عدسة على عدسة تسمى عدسة العين. عادةً ما تقوم العدسات العينية بتكبير الصور 10 مرات (10). في الطرف الآخر من أنبوب الجسم توجد مجموعة من العدسات الموضوعية على أنف دوار. تتراوح نسبة تكبير هذه العدسات الموضوعية عادةً من 4إلى 100، مع تحديد التكبير لكل عدسة على الغلاف المعدني للعدسة. تعمل العدسات العينية والموضوعية معًا لإنشاء صورة مكبرة. التكبير الكلي هو نتاج التكبير العيني مضروبًا في التكبير الموضوعي:
\[\text{ocular magnification} \times \text{objective magnification} \nonumber\]
على سبيل المثال، إذا تم اختيار عدسة\(40 \times\) موضوعية وتم تحديد العدسة العينية\(10\times\)، فسيكون التكبير الكلي
\[(40×)(10×)=400× \nonumber\]
مكونات مجهر برايتفيلد النموذجي.
يُطلق على العنصر الذي يتم عرضه اسم العينة. يتم وضع العينة على شريحة زجاجية، ثم يتم تثبيتها في مكانها على خشبة المسرح (منصة) من المجهر. بمجرد تأمين الشريحة، يتم وضع العينة الموجودة على الشريحة فوق الضوء باستخدام مقابض المرحلة الميكانيكية xy. تقوم هذه المقابض بتحريك الشريحة على سطح المسرح، ولكن لا ترفع أو تخفض المرحلة. بمجرد أن تتمركز العينة فوق الضوء، يمكن رفع موضع المسرح أو خفضه لتركيز الصورة. يُستخدم مقبض التركيز الخشن للحركات واسعة النطاق مع عدسات موضوعية 4و 10؛ يُستخدم مقبض التركيز الدقيق للحركات الصغيرة، خاصة مع العدسات الموضوعية 40أو 100.
عندما يتم تكبير الصور، فإنها تصبح أكثر تعتيمًا نظرًا لوجود إضاءة أقل لكل وحدة مساحة من الصورة. لذلك، تتطلب الصور المكبرة للغاية التي تنتجها المجاهر إضاءة مكثفة. في مجهر برايتفيلد، يتم توفير هذا الضوء بواسطة جهاز إضاءة، وهو عادةً مصباح عالي الكثافة تحت المسرح. يمر الضوء المنبعث من المصباح عبر عدسة المكثف (الموجودة أسفل المسرح)، والتي تركز جميع أشعة الضوء على العينة لزيادة الإضاءة إلى أقصى حد. يمكن تحسين موضع المكثف باستخدام مقبض تركيز المكثف المرفق؛ بمجرد تحديد المسافة المثلى، يجب عدم تحريك المكثف لضبط السطوع. في حالة الحاجة إلى مستويات إضاءة أقل من الحد الأقصى، يمكن ضبط كمية الضوء التي تضرب العينة بسهولة عن طريق فتح أو إغلاق الحجاب الحاجز بين المكثف والعينة. في بعض الحالات، يمكن أيضًا ضبط السطوع باستخدام الريوستات، وهو مفتاح خافت يتحكم في شدة الإضاءة.
يقوم مجهر المجال الساطع بإنشاء صورة عن طريق توجيه الضوء من جهاز الإضاءة إلى العينة؛ ويتم نقل هذا الضوء بشكل مختلف أو امتصاصه أو انعكاسه أو كسره بواسطة هياكل مختلفة. يمكن أن تتصرف الألوان المختلفة بشكل مختلف عندما تتفاعل مع الكروموفوريات (الأصباغ التي تمتص وتعكس أطوال موجية معينة من الضوء) في أجزاء من العينة. في كثير من الأحيان، تتم إضافة الكروموفور بشكل مصطنع إلى العينة باستخدام البقع، والتي تعمل على زيادة التباين والدقة. بشكل عام، ستظهر الهياكل في العينة أغمق، بدرجات مختلفة، من الخلفية الساطعة، مما يؤدي إلى إنشاء صور فائقة الوضوح عند تكبير يصل إلى حوالي 1000 متر. سيؤدي التكبير الإضافي إلى إنشاء صورة أكبر، ولكن بدون زيادة الدقة. يتيح لنا ذلك رؤية أشياء صغيرة مثل البكتيريا، والتي يمكن رؤيتها عند حوالي 400 متر أو نحو ذلك، ولكن ليس الأشياء الصغيرة مثل الفيروسات.
في حالات التكبير العالية جدًا، قد تتأثر الدقة عندما يمر الضوء عبر كمية صغيرة من الهواء بين العينة والعدسة. ويرجع ذلك إلى الاختلاف الكبير بين مؤشرات الانكسار للهواء والزجاج؛ حيث يقوم الهواء بتشتيت أشعة الضوء قبل أن تتمكن العدسة من تركيزها. لحل هذه المشكلة، يمكن استخدام قطرة من الزيت لملء الفراغ بين العينة وعدسة الغمر بالزيت، وهي عدسة خاصة مصممة للاستخدام مع زيوت الغمر. نظرًا لأن الزيت يحتوي على معامل انكسار مشابه جدًا لمعامل الزجاج، فإنه يزيد من الزاوية القصوى التي يمكن للضوء الخارج من العينة أن يصطدم بها العدسة. يؤدي هذا إلى زيادة الضوء الذي تم جمعه وبالتالي دقة الصورة (الشكل\(\PageIndex{2}\)). يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الزيوت لأنواع مختلفة من الضوء.
حتى المجهر القوي جدًا لا يمكنه تقديم صور عالية الدقة إذا لم يتم تنظيفه وصيانته بشكل صحيح. نظرًا لأن العدسات مصممة ومصنعة بعناية لإنكسار الضوء بدرجة عالية من الدقة، فحتى العدسات المتسخة أو المخدوشة قليلاً ستكسر الضوء بطرق غير مقصودة، مما يؤدي إلى تدهور صورة العينة. بالإضافة إلى ذلك، تعد المجاهر أدوات حساسة نوعًا ما، ويجب توخي الحذر الشديد لتجنب إتلاف الأجزاء والأسطح. من بين أمور أخرى، تشمل الرعاية المناسبة للمجهر ما يلي:
- تنظيف العدسات باستخدام ورق العدسة
- عدم السماح للعدسات بالاتصال بالشريحة (على سبيل المثال، عن طريق تغيير التركيز بسرعة)
- حماية المصباح (إذا كان موجودًا) من الكسر
- عدم دفع هدف إلى شريحة
- عدم استخدام مقبض التركيز الخشن عند استخدام العدسات الموضوعية 40أو أكثر
- فقط باستخدام زيت الغمر مع هدف زيتي متخصص، وعادة ما يكون الهدف 100
- زيت التنظيف من عدسات الغمر بعد استخدام المجهر
- تنظيف أي زيت يتم نقله عن طريق الخطأ من العدسات الأخرى
- تغطية المجهر أو وضعه في خزانة عند عدم استخدامه
مجهر داركفيلد
مجهر الحقل المظلم هو مجهر ذو مجال مشرق يحتوي على تعديل صغير ولكنه مهم للمكثف. يتم وضع قرص صغير معتم (قطره حوالي 1 سم) بين المصباح وعدسة المكثف. يقوم هذا الفاصل الضوئي المعتم، كما يسمى القرص، بحجب معظم الضوء من المصباح أثناء مروره عبر المكثف في طريقه إلى العدسة المستهدفة، مما ينتج مخروطًا مجوفًا من الضوء يركز على العينة. الضوء الوحيد الذي يصل إلى الهدف هو الضوء الذي انكسر أو انعكس بواسطة الهياكل في العينة. تعرض الصورة الناتجة عادةً كائنات مشرقة على خلفية داكنة (الشكل\(\PageIndex{3}\))
يتم استخدام نقطة توقف الضوء المعتمة التي يتم إدخالها في مجهر المجال الساطع لإنتاج صورة المجال المظلم. يمنع توقف الضوء الضوء الذي ينتقل مباشرة من المصباح إلى العدسة المستهدفة، مما يسمح فقط للضوء المنعكس أو المنكسر عن العينة بالوصول إلى العين.
يمكن للفحص المجهري Darkfield في كثير من الأحيان إنشاء صور عالية التباين وعالية الدقة للعينات دون استخدام البقع، وهو أمر مفيد بشكل خاص لعرض العينات الحية التي قد تُقتل أو تتعرض للخطر بسبب البقع. على سبيل المثال، يمكن رؤية اللولبيات الرقيقة مثل Treponema pallidum، العامل المسبب لمرض الزهري، بشكل أفضل باستخدام مجهر الحقل المظلم (الشكل\(\PageIndex{4}\)).
يسمح لنا استخدام مجهر الحقل المظلم بمشاهدة عينات حية غير ملوثة من اللولبية اللولبية اللولبية الشاحبة. على غرار الصورة الفوتوغرافية السلبية، تبدو اللولبيات مشرقة على خلفية داكنة. (مصدر: مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها/سي دبليو هوبارد)
التمارين\(\PageIndex{1}\)
حدد الاختلافات الرئيسية بين الفحص المجهري في برايتفيلد وداركفيلد.
التركيز السريري: الجزء 2
يمكن أن تحدث عدوى الجروح مثل Cindy بسبب العديد من أنواع البكتيريا المختلفة، والتي يمكن أن ينتشر بعضها بسرعة مع مضاعفات خطيرة. يعد تحديد السبب المحدد أمرًا مهمًا للغاية لاختيار دواء يمكنه قتل أو إيقاف نمو البكتيريا.
بعد الاتصال بطبيب محلي حول حالة سيندي، ترسل ممرضة المخيم العينة من الجرح إلى أقرب مختبر طبي. لسوء الحظ، نظرًا لأن المخيم يقع في منطقة نائية، فإن أقرب مختبر صغير وغير مجهز بشكل جيد. من المحتمل أن يستخدم المختبر الأكثر حداثة طرقًا أخرى لزراعة البكتيريا ونموها والتعرف عليها، ولكن في هذه الحالة، يقرر الفني صنع حامل مبلل من العينة وعرضه تحت مجهر برايتفيلد. في الحامل الرطب، تتم إضافة قطرة صغيرة من الماء إلى الشريحة، ويتم وضع زلة غطاء فوق العينة لإبقائها في مكانها قبل وضعها تحت العدسة المستهدفة.
تحت مجهر برايتفيلد، بالكاد يستطيع الفني رؤية خلايا البكتيريا لأنها شفافة تقريبًا على الخلفية الساطعة. لزيادة التباين، يقوم الفني بإدخال نقطة توقف ضوء معتمة فوق وحدة الإضاءة. تظهر صورة الحقل المظلم الناتجة بوضوح أن خلايا البكتيريا كروية ومجمعة في مجموعات، مثل العنب.
- لماذا من المهم تحديد شكل وأنماط نمو الخلايا في العينة؟
- ما هي أنواع الفحص المجهري الأخرى التي يمكن استخدامها بفعالية لعرض هذه العينة؟
مجاهر التباين الطوري
تستخدم مجاهر التباين الطوري الانكسار والتداخل الناتج عن الهياكل الموجودة في العينة لإنشاء صور عالية التباين وعالية الدقة دون تلطيخ. إنه أقدم وأبسط نوع من الميكروسكوب الذي ينشئ صورة عن طريق تغيير الأطوال الموجية لأشعة الضوء التي تمر عبر العينة. لإنشاء مسارات متغيرة للأطوال الموجية، يتم استخدام نقطة توقف حلقية في المكثف. ينتج التوقف الحلقي مخروطًا مجوفًا من الضوء يركز على العينة قبل الوصول إلى العدسة الموضوعية. يحتوي الهدف على لوحة طور تحتوي على حلقة طورية. ونتيجة لذلك، يمر الضوء المنتقل مباشرة من المصباح عبر الحلقة الطورية بينما يمر الضوء المنكسر أو المنعكس بواسطة العينة عبر اللوحة. يؤدي هذا إلى أن تكون الموجات التي تنتقل عبر الحلقة حوالي نصف الطول الموجي خارج الطور مع تلك التي تمر عبر اللوحة. نظرًا لأن الموجات لها قمم وأحواض، يمكن أن تتجمع معًا (إذا كانت في طور معًا) أو تلغي بعضها البعض (إذا كانت خارج الطور). عندما تكون الأطوال الموجية خارج الطور، فإن أحواض الموجات ستلغي قمم الموجة، وهو ما يسمى بالتداخل المدمر. ثم تظهر الهياكل التي تكسر الضوء داكنة على خلفية مشرقة من الضوء غير المنكسر فقط. بشكل عام، ستختلف الهياكل التي تختلف في الميزات مثل معامل الانكسار في مستويات الظلام (الشكل\(\PageIndex{5}\)).
يوضح هذا الرسم التخطيطي لمجهر التباين الطوري اختلافات الطور بين الضوء المار عبر الكائن والخلفية. تنتج هذه الاختلافات عن طريق تمرير الأشعة عبر أجزاء مختلفة من لوحة الطور. يتم تثبيت أشعة الضوء في مستوى الصورة، مما ينتج تباينًا بسبب تداخلها.
نظرًا لأنه يزيد من التباين دون الحاجة إلى بقع، غالبًا ما يستخدم الفحص المجهري الطوري لمراقبة العينات الحية. يتم تصور بعض الهياكل، مثل العضيات في الخلايا حقيقية النواة والمسام الداخلية في الخلايا بدائية النواة، بشكل جيد بشكل خاص من خلال الفحص المجهري الطوري (الشكل\(\PageIndex{6}\)).
يقارن هذا الشكل صورة المجال الساطع (على اليسار) مع صورة التباين الطوري (على اليمين) لنفس الخلايا الظهارية الحرشفية البسيطة غير الملطخة. توجد الخلايا في منتصف وأسفل يمين كل صورة (العنصر غير المنتظم فوق الخلايا هو الحطام اللاخلوي). لاحظ أن الخلايا غير الملطخة في صورة Brightfield تكاد تكون غير مرئية على الخلفية، بينما تبدو الخلايا في صورة التباين الطوري متوهجة على الخلفية، مما يكشف عن مزيد من التفاصيل. (مصدر: «الكفير بشكل واضح» /ويكيميديا كومنز)
مجاهر تباين التداخل التفاضلي
تتشابه مجاهر تباين التداخل التفاضلي (DIC) (المعروفة أيضًا باسم بصريات Nomarski) مع مجاهر التباين الطوري من حيث أنها تستخدم أنماط التداخل لتعزيز التباين بين الميزات المختلفة للعينة. في مجهر DIC، يتم إنشاء شعاعين من الضوء يختلف فيهما اتجاه حركة الموجة (الاستقطاب). بمجرد مرور الحزم عبر العينة أو المساحة الخالية من العينات، يتم إعادة تجميعها وتتسبب تأثيرات العينات في اختلافات في أنماط التداخل الناتجة عن دمج الحزم. ينتج عن هذا صور عالية التباين للكائنات الحية ذات المظهر ثلاثي الأبعاد. هذه المجاهر مفيدة بشكل خاص في تمييز الهياكل داخل العينات الحية غير الملطخة. (الشكل\(\PageIndex{7}\)).
صورة DIC لفونسيكايا بيدروسوي نمت على أجار ليونيان المعدل. تسبب هذه الفطريات داء الكروموبلاستوميكوسيس، وهو عدوى جلدية مزمنة شائعة في المناخات الاستوائية وشبه الاستوائية.
التمارين\(\PageIndex{2}\)
ما هي بعض مزايا التباين الطوري والفحص المجهري DIC؟
الميكروسكوبات الفلورية
يستخدم المجهر الفلوري الكروموفوريات الفلورية التي تسمى الفلوروكرومات، والتي تكون قادرة على امتصاص الطاقة من مصدر الضوء ثم انبعاث هذه الطاقة كضوء مرئي. تشتمل الفلوروكرومات على مواد فلورية طبيعية (مثل الكلوروفيل) بالإضافة إلى بقع الفلورسنت التي تتم إضافتها إلى العينة لخلق التباين. تعتبر الأصباغ مثل أحمر تكساس و FITC أمثلة على الفلوروكرومات. تشمل الأمثلة الأخرى أصباغ الحمض النووي 4',6'-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) والبرتقال الأكريدين.
ينقل المجهر ضوء الإثارة، وهو عمومًا شكل من أشكال EMR بطول موجة قصير، مثل الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق، نحو العينة؛ تمتص الكروموفوريات ضوء الإثارة وتصدر ضوءًا مرئيًا بأطوال موجية أطول. ثم يتم تصفية ضوء الإثارة (جزئيًا لأن الأشعة فوق البنفسجية ضارة بالعينين) بحيث يمر الضوء المرئي فقط عبر العدسة العينية. ينتج عن ذلك صورة للعينة بألوان زاهية على خلفية داكنة.
تعد المجاهر الفلورية مفيدة بشكل خاص في علم الأحياء الدقيقة السريرية. يمكن استخدامها لتحديد مسببات الأمراض، للعثور على أنواع معينة داخل البيئة، أو للعثور على مواقع جزيئات وهياكل معينة داخل الخلية. كما تم تطوير مناهج للتمييز بين الخلايا الحية والميتة باستخدام الفحص المجهري الفلوري بناءً على ما إذا كانت تتناول فلوروكرومات معينة. في بعض الأحيان، يتم استخدام الفلوروكرومات المتعددة في نفس العينة لإظهار الهياكل أو الميزات المختلفة.
واحدة من أهم تطبيقات الفحص المجهري الفلوري هي تقنية تسمى الفلورة المناعية، والتي تستخدم لتحديد بعض الميكروبات المسببة للأمراض من خلال ملاحظة ما إذا كانت الأجسام المضادة مرتبطة بها. (الأجسام المضادة هي جزيئات بروتينية ينتجها الجهاز المناعي وترتبط بمسببات أمراض معينة لقتلها أو تثبيطها.) هناك طريقتان لهذه التقنية: مقايسة الفلورة المناعية المباشرة (DFA) ومقايسة الفلورة المناعية غير المباشرة (IFA). في DFA، يتم تلطيخ الأجسام المضادة المحددة (مثل تلك التي تستهدف فيروس داء الكلب) بالفلوروكروم. إذا كانت العينة تحتوي على العامل الممرض المستهدف، يمكن للمرء أن يلاحظ الأجسام المضادة المرتبطة بالعامل الممرض تحت المجهر الفلوري. يُطلق على هذا اسم بقعة الجسم المضاد الأولية لأن الأجسام المضادة الملطخة ترتبط مباشرة بالعامل الممرض.
في IFA، يتم تلوين الأجسام المضادة الثانوية بالفلوروكروم بدلاً من الأجسام المضادة الأولية. لا ترتبط الأجسام المضادة الثانوية مباشرة بمسببات الأمراض، ولكنها ترتبط بالأجسام المضادة الأولية. عندما ترتبط الأجسام المضادة الأولية غير الملوثة بالعامل الممرض، يمكن ملاحظة الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المرتبطة بالأجسام المضادة الأولية. وبالتالي، يتم ربط الأجسام المضادة الثانوية بشكل غير مباشر بمسببات الأمراض. نظرًا لأن الأجسام المضادة الثانوية المتعددة يمكن أن ترتبط غالبًا بالجسم المضاد الأساسي، فإن IFA يزيد من عدد الأجسام المضادة الفلورية المرتبطة بالعينة، مما يجعل من السهل تصور الميزات في العينة (الشكل\(\PageIndex{8}\)).
التمارين\(\PageIndex{3}\)
لماذا يجب استخدام الفلوروكرومات لفحص عينة تحت المجهر الفلوري؟
مجاهر أحادية البؤرة
في حين أن الأشكال الأخرى من الفحص المجهري الضوئي تخلق صورة يتم تركيزها إلى أقصى حد على مسافة واحدة من الراصد (العمق، أو المستوى z)، يستخدم المجهر متحد البؤرة الليزر لمسح مستويات z متعددة على التوالي. ينتج عن هذا العديد من الصور ثنائية الأبعاد وعالية الدقة على أعماق مختلفة، والتي يمكن بناؤها في صورة ثلاثية الأبعاد بواسطة الكمبيوتر. كما هو الحال مع المجاهر الفلورية، تُستخدم البقع الفلورية عمومًا لزيادة التباين والدقة. يتم تحسين وضوح الصورة بشكل إضافي من خلال فتحة ضيقة تزيل أي ضوء ليس من المستوى z. وبالتالي فإن المجاهر متحدة البؤرة مفيدة جدًا لفحص العينات السميكة مثل الأغشية الحيوية، والتي يمكن فحصها حية وغير مثبتة (الشكل\(\PageIndex{9}\)).
مجاهر ثنائية الفوتون
في حين سمحت المجاهر الفلورية والموحدة الأصلية بتصور أفضل للميزات الفريدة في العينات، لا تزال هناك مشاكل تمنع التصور الأمثل. كانت الحساسية الفعالة للفحص المجهري الفلوري عند عرض العينات السميكة محدودة بشكل عام بسبب التوهج خارج التركيز، مما أدى إلى ضعف الدقة. تم تقليل هذا القيد بشكل كبير في المجهر متحد البؤرة من خلال استخدام الثقب متحد البؤرة لرفض التألق في الخلفية خارج التركيز بأقسام بصرية رقيقة (<1 ميكرومتر) وغير واضحة. ومع ذلك، حتى المجاهر متحدة البؤرة تفتقر إلى الدقة اللازمة لعرض عينات الأنسجة السميكة. تم حل هذه المشكلات من خلال تطوير المجهر ثنائي الفوتون، والذي يستخدم تقنية المسح والفلوروكروم والضوء ذو الطول الموجي الطويل (مثل الأشعة تحت الحمراء) لتصور العينات. تعني الطاقة المنخفضة المرتبطة بالضوء ذي الطول الموجي الطويل أنه يجب أن يضرب فوتونان موقعًا في نفس الوقت لإثارة الفلوروكروم. تكون الطاقة المنخفضة لضوء الإثارة أقل ضررًا للخلايا، كما أن الطول الموجي الطويل لضوء الإثارة يتغلغل بسهولة في عمق العينات السميكة. هذا يجعل المجهر ثنائي الفوتون مفيدًا لفحص الخلايا الحية داخل الأنسجة السليمة - شرائح الدماغ والأجنة والأعضاء الكاملة وحتى الحيوانات بأكملها.
في الوقت الحالي، يقتصر استخدام الميكروسكوب ثنائي الفوتون على المختبرات السريرية والبحثية المتقدمة بسبب ارتفاع تكاليف الأدوات. عادةً ما يكلف مجهر واحد ثنائي الفوتون ما بين 300,000 دولار و 500,000 دولار، كما أن الليزر المستخدم لإثارة الأصباغ المستخدمة في العينات مكلف للغاية. ومع ذلك، مع تحسن التكنولوجيا، قد تصبح المجاهر ثنائية الفوتون متاحة بسهولة أكبر في البيئات السريرية.
التمارين\(\PageIndex{4}\)
ما أنواع العينات التي يتم فحصها بشكل أفضل باستخدام الفحص المجهري متحد البؤرة أو ثنائي الفوتون؟
الفحص المجهري الإلكتروني
الحد الأقصى للدقة النظرية للصور التي تم إنشاؤها بواسطة مجاهر الضوء محدود في النهاية بالأطوال الموجية للضوء المرئي. يمكن لمعظم مجاهر الضوء تكبير 1000فقط، ويمكن لعدد قليل منها التكبير حتى 1500، ولكن هذا لا يبدأ في الاقتراب من القوة المكبرة للمجهر الإلكتروني (EM)، الذي يستخدم الحزم الإلكترونية ذات الطول الموجي القصير بدلاً من الضوء لزيادة التكبير والدقة.
يمكن للإلكترونات، مثل الإشعاع الكهرومغناطيسي، أن تتصرف كموجات، ولكن بأطوال موجية تبلغ 0.005 نانومتر، يمكنها إنتاج دقة أفضل بكثير من الضوء المرئي. يمكن لـ EM إنتاج صورة واضحة يتم تكبيرها حتى 100,000. وبالتالي، يمكن لـ EMS حل الهياكل تحت الخلوية وكذلك بعض الهياكل الجزيئية (على سبيل المثال، خيوط مفردة من الحمض النووي)؛ ومع ذلك، لا يمكن استخدام الفحص المجهري الإلكتروني على المواد الحية بسبب الطرق اللازمة لإعداد العينات.
هناك نوعان أساسيان من EM: المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) ومجهر المسح الإلكتروني (SEM) (الشكل\(\PageIndex{10}\)). يشبه TEM إلى حد ما مجهر ضوء Brightfield من حيث الطريقة التي يعمل بها. ومع ذلك، فإنه يستخدم شعاعًا إلكترونيًا من فوق العينة التي يتم تركيزها باستخدام عدسة مغناطيسية (بدلاً من عدسة زجاجية) ويتم عرضها من خلال العينة على كاشف. تمر الإلكترونات عبر العينة، ثم يلتقط الكاشف الصورة (الشكل\(\PageIndex{11}\)).
لكي تمر الإلكترونات عبر العينة في TEM، يجب أن تكون العينة رقيقة للغاية (بسمك 20-100 نانومتر). تم إنتاج الصورة بسبب اختلاف العتامة في أجزاء مختلفة من العينة. يمكن تعزيز هذه العتامة عن طريق تلطيخ العينة بمواد مثل المعادن الثقيلة، والتي تكون كثيفة الإلكترون. تتطلب TEM أن تكون الحزمة والعينة في فراغ وأن تكون العينة رقيقة جدًا وجافة. تتم مناقشة الخطوات المحددة اللازمة لإعداد عينة للمراقبة تحت EM بالتفصيل في القسم التالي.
تشكل SEM صورًا لأسطح العينات، عادةً من الإلكترونات التي يتم إزالتها من العينات بواسطة شعاع من الإلكترونات. يمكن أن يؤدي ذلك إلى إنشاء صور مفصلة للغاية بمظهر ثلاثي الأبعاد يتم عرضها على الشاشة (الشكل\(\PageIndex{12}\)). عادةً ما يتم تجفيف العينات وتحضيرها باستخدام مثبتات تقلل من القطع الأثرية، مثل الذوبان، التي يمكن إنتاجها عن طريق التجفيف، قبل تغليفها بطبقة رقيقة من المعدن مثل الذهب. في حين أن الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال يتطلب أقسامًا رقيقة جدًا ويسمح للمرء برؤية الهياكل الداخلية مثل العضيات والأجزاء الداخلية للأغشية، يمكن استخدام الفحص المجهري الإلكتروني لعرض أسطح الأجسام الكبيرة (مثل حبوب اللقاح) وكذلك أسطح العينات الصغيرة جدًا ( الشكل\(\PageIndex{13}\)). يمكن لبعض EMS تكبير صورة حتى 2,000,000. 1
التمارين\(\PageIndex{5}\)
- ما هي بعض مزايا وعيوب الفحص المجهري الإلكتروني، على عكس الفحص المجهري الضوئي، لفحص العينات الميكروبيولوجية؟
- ما أنواع العينات التي يتم فحصها بشكل أفضل باستخدام TEM؟ سيم؟
البيوفيلم هو مجتمع معقد من نوع واحد أو أكثر من الكائنات الحية الدقيقة، وعادة ما يتشكل كطبقة لزجة متصلة بالسطح بسبب إنتاج مادة خارج البوليمر (EPS) تلتصق بالسطح أو عند الواجهة بين الأسطح (على سبيل المثال، بين الهواء والماء). في الطبيعة، تكون الأغشية الحيوية وفيرة وتحتل في كثير من الأحيان منافذ معقدة داخل النظم البيئية (الشكل\(\PageIndex{14}\)). في الطب، يمكن للأفلام الحيوية تغطية الأجهزة الطبية وتوجد داخل الجسم. نظرًا لامتلاكها خصائص فريدة، مثل زيادة المقاومة ضد الجهاز المناعي والأدوية المضادة للميكروبات، فإن الأغشية الحيوية ذات أهمية خاصة لعلماء الأحياء الدقيقة والأطباء على حد سواء.
نظرًا لأن الأغشية الحيوية سميكة، فلا يمكن ملاحظتها جيدًا باستخدام الفحص المجهري الضوئي؛ قد يؤدي تقطيع الأغشية الحيوية لإنشاء عينة أرق إلى قتل أو إزعاج المجتمع الميكروبي. يوفر الفحص المجهري متحد البؤرة صورًا أوضح للأفلام الحيوية لأنه يمكنه التركيز على مستوى z واحد في كل مرة وإنتاج صورة ثلاثية الأبعاد لعينة سميكة. يمكن أن تكون الأصباغ الفلورية مفيدة في تحديد الخلايا داخل المصفوفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تقنيات مثل الفلورة المناعية والتهجين الموضعي (FISH)، حيث تُستخدم المجسات الفلورية للربط بالحمض النووي.
يمكن استخدام الفحص المجهري الإلكتروني لمراقبة الأغشية الحيوية، ولكن فقط بعد تجفيف العينة، مما ينتج عنه قطع أثرية غير مرغوب فيها ويشوه العينة. بالإضافة إلى هذه الأساليب، من الممكن متابعة التيارات المائية من خلال الأشكال (مثل المخاريط والفطر) للأفلام الحيوية، باستخدام فيديو لحركة الخرز المطلي بالفلور (الشكل\(\PageIndex{15}\)).
الفحص المجهري لمسبار المسح
لا يستخدم مجهر مسبار المسح الضوء أو الإلكترونات، بل يستخدم مجسات حادة جدًا يتم تمريرها فوق سطح العينة وتتفاعل معها بشكل مباشر. ينتج عن ذلك معلومات يمكن تجميعها في صور بتكبير يصل إلى 100,000. يمكن استخدام هذه المكبرات الكبيرة لمراقبة الذرات الفردية على الأسطح. حتى الآن، تم استخدام هذه التقنيات في المقام الأول للبحث وليس للتشخيص.
هناك نوعان من مجهر مسبار المسح: مجهر المسح النفقي (STM) ومجهر القوة الذرية (AFM). يستخدم STM مسبارًا يتم تمريره فوق العينة مباشرةً حيث أن تحيز الجهد المستمر يخلق احتمالية وجود تيار كهربائي بين المسبار والعينة. يحدث هذا التيار عن طريق النفق الكمي للإلكترونات بين المسبار والعينة، وتعتمد شدة التيار على المسافة بين المسبار والعينة. يتم تحريك المسبار أفقيًا فوق السطح ويتم قياس شدة التيار. يمكن للفحص المجهري النفقي رسم خريطة فعالة لهيكل الأسطح بدقة يمكن من خلالها اكتشاف الذرات الفردية.
على غرار STM، تحتوي أجهزة AFM على مسبار رقيق يتم تمريره فوق العينة مباشرةً. ومع ذلك، بدلاً من قياس الاختلافات في التيار عند ارتفاع ثابت فوق العينة، يحدد AFM تيارًا ثابتًا ويقيس الاختلافات في ارتفاع طرف المسبار أثناء مروره فوق العينة. عندما يمر طرف المسبار فوق العينة، تتسبب القوى بين الذرات (قوى فان دير فالس، والقوى الشعرية، والترابط الكيميائي، والقوى الكهروستاتيكية، وغيرها) في تحركها لأعلى ولأسفل. يتم تحديد انحراف طرف المسبار وقياسه باستخدام قانون هوك للمرونة، ويتم استخدام هذه المعلومات لإنشاء صور لسطح العينة بدقة على المستوى الذري (الشكل\(\PageIndex{16}\)).
التمارين\(\PageIndex{6}\)
- ما الذي يحتوي على نسبة تكبير أعلى، أو المجهر الضوئي أو مجهر المسبار؟
- اذكر ميزة واحدة وقيدًا واحدًا للفحص المجهري لمسبار المسح.
المفاهيم الأساسية والملخص
- تستخدم أنواع عديدة من المجاهر تقنيات مختلفة لتوليد الصور المجهرية. معظمها مفيد لنوع معين من العينات أو التطبيقات.
- يستخدم الفحص المجهري الضوئي العدسات لتركيز الضوء على عينة لإنتاج صورة. تشمل مجاهر الضوء الشائعة الاستخدام مجاهر المجال الساطع، والمجال المظلم، والتباين الطوري، وتباين التداخل التفاضلي، والفلورة، ومجهر البؤرة، ومجهر الفوتون الثنائي.
- يعمل الفحص المجهري الإلكتروني على تركيز الإلكترونات على العينة باستخدام المغناطيس، مما ينتج عنه نسبة تكبير أكبر بكثير من الفحص المجهري الضوئي. مجهر الإرسال الإلكتروني (TEM) ومجهر المسح الإلكتروني (SEM) هما شكلان شائعان.
- ينتج الفحص المجهري لمسبار المسح صورًا ذات تكبير أكبر من خلال قياس التغذية الراجعة من المجسات الحادة التي تتفاعل مع العينة. تشمل مجاهر المسبار مجهر المسح النفقي (STM) ومجهر القوة الذرية (AFM).
الحواشي
- 1 «مجهر ناقل الحركة الإلكتروني JEM-ARM200F»، شركة جيول يو إس إيه، www.jeolusa.com/Products/Tran... المواصفات. تم الوصول إليه في 8/28/2015.
مسرد المصطلحات
- مجهر القوة الذرية
- مجهر مسح يستخدم مسبارًا رقيقًا يتم تمريره فوق العينة مباشرة لقياس القوى بين الذرات والمسبار
- مجهر
- وجود عدستين
- مجهر برايتفيلد
- مجهر ضوئي مركب مع عدستين؛ ينتج صورة داكنة على خلفية مشرقة
- مقبض تركيز خشن
- مقبض على المجهر ينتج حركات كبيرة نسبيًا لضبط التركيز
- الكروموفور
- أصباغ تمتص وتعكس أطوال موجية معينة من الضوء (تمنحها لونًا)
- عدسة المكثف
- عدسة على مجهر تركز الضوء من مصدر الضوء على العينة
- المجهر متحد البؤرة
- مجهر ليزر المسح الذي يستخدم الأصباغ الفلورية وأشعة الليزر المثيرة لإنشاء صور ثلاثية الأبعاد
- مجهر داركفيلد
- مجهر ضوئي مركب ينتج صورة مشرقة على خلفية داكنة؛ عادةً ما يكون مجهر برايتفيلد المعدل
- الحجاب الحاجز
- أحد مكونات المجهر؛ يتكون عادةً من قرص تحت المسرح به ثقوب بأحجام مختلفة؛ يمكن تعديله للسماح بدخول المزيد أو أقل من الضوء من مصدر الضوء إلى العينة
- مجهر التداخل التفاضلي والتباين
- مجهر يستخدم الضوء المستقطب لزيادة التباين
- مجهر إلكتروني
- نوع من الميكروسكوب يستخدم الحزم الإلكترونية ذات الطول الموجي القصير بدلاً من الضوء لزيادة التكبير والدقة
- مقبض التركيز الدقيق
- مقبض على المجهر ينتج حركات صغيرة نسبيًا لضبط التركيز
- مجهر الفلورسينية
- مجهر يستخدم الفلوروكرومات الطبيعية أو بقع الفلورسنت لزيادة التباين
- الفلوروكرومات
- الكروموفوريات التي تتألق (تمتص الضوء ثم تنبعث منه)
- إضاءة
- مصدر الضوء على المجهر
- الفلورسينية المناعية
- تقنية تستخدم المجهر الفلوري والفلوروكرومات الخاصة بالأجسام المضادة لتحديد وجود مسببات أمراض معينة في العينة
- أحادي العين
- وجود عدسة واحدة
- عدسات موضوعية
- على المجهر الضوئي، العدسات الأقرب إلى العينة، والتي عادة ما تكون موجودة في نهايات الأبراج
- عدسة عينية
- على المجهر، العدسة الأقرب إلى العين (وتسمى أيضًا العدسة)
- عدسة الغمر بالزيت
- عدسة موضوعية خاصة على مجهر مصممة للاستخدام مع زيت الغمر لتحسين الدقة
- مجهر التباين الطوري
- مجهر ضوئي يستخدم التوقف الحلقي واللوحة الحلقية لزيادة التباين
- ريوستات
- مفتاح خافت يتحكم في شدة الإضاءة على المجهر الضوئي
- مجهر المسح الإلكتروني (SEM)
- نوع من الميكروسكوب الإلكتروني الذي يرتد الإلكترونات من العينة، ويشكل صورة للسطح
- مجهر المسح
- مجهر يستخدم مسبارًا ينتقل عبر سطح العينة على مسافة ثابتة بينما يتم قياس التيار الحساس لحجم الفجوة
- مجهر المسح النفقي
- المجهر الذي يستخدم مسبارًا يتم تمريره فوق العينة مباشرة كتحيز ثابت للجهد يخلق إمكانية وجود تيار كهربائي بين المسبار والعينة
- المسرح
- منصة المجهر التي يتم وضع الشرائح عليها
- التكبير الكلي
- في المجهر الضوئي هي قيمة يتم حسابها بضرب تكبير العين بتكبير العدسات الموضوعية
- مجهر الإرسال الإلكتروني (TEM)
- نوع من الميكروسكوب الإلكتروني الذي يستخدم شعاعًا إلكترونيًا يركز على المغناطيس ويمر عبر عينة رقيقة
- مجهر ثنائي الفوتون
- مجهر يستخدم ضوء الطول الموجي الطويل أو الأشعة تحت الحمراء لتلميع الفلوروكرومات في العينة
- مقابض المسرح الميكانيكية xy
- المقابض الموجودة على المجهر والتي تُستخدم لضبط موضع العينة على سطح المسرح، بشكل عام لتوسيطها مباشرة فوق الضوء