7.5: שימוש בביוכימיה לזיהוי מיקרואורגניזמים
- Page ID
- 209013
מטרות למידה
- תאר דוגמאות למוצרי ביוסינתזה בתוך תא שניתן לזהות לזיהוי חיידקים
זיהוי מדויק של מבודדי חיידקים חיוני במעבדה למיקרוביולוגיה קלינית מכיוון שהתוצאות לרוב מודיעות על החלטות לגבי טיפול המשפיעות ישירות על תוצאות המטופל. לדוגמה, מקרים של הרעלת מזון דורשים זיהוי מדויק של הגורם הסיבתי, כך שרופאים יכולים לרשום טיפול מתאים. כמו כן, חשוב לזהות במדויק את הפתוגן הסיבתי במהלך התפרצות מחלה, כך שניתן יהיה להשתמש באסטרטגיות מתאימות להכיל את המגיפה.
ישנן דרכים רבות לזהות, לאפיין ולזהות מיקרואורגניזמים. שיטות מסוימות מסתמכות על מאפיינים ביוכימיים פנוטיפיים, בעוד שאחרות משתמשות בזיהוי גנוטיפי. המאפיינים הביוכימיים של חיידק מספקים תכונות רבות שימושיות לסיווג וזיהוי. ניתוח היכולות התזונתיות והמטבוליות של הבידוד החיידקי הוא גישה נפוצה לקביעת הסוג ומין החיידק. כמה מהמסלולים המטבוליים החשובים ביותר שבהם משתמשים חיידקים כדי לשרוד יידונו בחילוף החומרים המיקרוביאלי. בחלק זה נדון בכמה שיטות המשתמשות במאפיינים ביוכימיים לזיהוי מיקרואורגניזמים.
חלק מהמיקרואורגניזמים מאחסנים תרכובות מסוימות כגרגירים בתוך הציטופלזמה שלהם, וניתן להשתמש בתוכן הגרגירים הללו למטרות זיהוי. לדוגמה, פולי-β-hydroxybutyrate (PHB) הוא תרכובת אחסון פחמן ואנרגיה המצויה בכמה חיידקים לא פלואורסצנטיים מהסוג Pseudomonas. ניתן לסווג מינים שונים בסוג זה על ידי נוכחות או היעדר PHB ופיגמנטים פלואורסצנטיים. הפתוגן האנושי P. aeruginosa והפתוגן הצמחי P. syringae הן שתי דוגמאות למיני Pseudomonas פלואורסצנטיים שאינם צוברים גרגירי PHB.
מערכות אחרות מסתמכות על מאפיינים ביוכימיים כדי לזהות מיקרואורגניזמים לפי התגובות הביוכימיות שלהם, כגון ניצול פחמן ובדיקות מטבוליות אחרות. במסגרות מעבדה קטנות או במעבדות הוראה, מבחנים אלה מבוצעים באמצעות מספר מצומצם של מבחנות. עם זאת, מערכות מודרניות יותר, כמו זו שפותחה על ידי Biolog, Inc., מבוססות על לוחות של תגובות ביוכימיות המבוצעות בו זמנית ומנותחות על ידי תוכנה. המערכת של ביולוג מזהה תאים על סמך יכולתם לחילוף חומרים ביוכימיים מסוימים ועל תכונותיהם הפיזיולוגיות, כולל pH ורגישות כימית. הוא משתמש בכל המעמדות העיקריים של ביוכימיקלים בניתוח שלו. ניתן לבצע זיהויים באופן ידני או עם המכשירים האוטומטיים למחצה או במלואם.
מערכת אוטומטית אחרת מזהה מיקרואורגניזמים על ידי קביעת ספקטרום המסה של הדגימה ולאחר מכן השוואתה למסד נתונים המכיל ספקטרום מסה ידוע לאלפי מיקרואורגניזמים. שיטה זו מבוססת על ספקטרומטריית מסה של לייזר בסיוע מטריצה/יינון זמן טיסה (MALDI-TOF) ומשתמשת בלוחות MALDI חד פעמיים שעליהן מעורבב המיקרואורגניזם עם מגיב מטריצה מיוחד (איור). \(\PageIndex{1}\) תערובת המדגמה/מגיב מוקרנת בלייזר אולטרה סגול פועם בעוצמה גבוהה, וכתוצאה מכך פליטה של יונים גזים הנוצרים מהמרכיבים הכימיים השונים של המיקרואורגניזם. יונים גזים אלה נאספים ומואצים דרך ספקטרומטר המסה, כאשר יונים נעים במהירות הנקבעת על ידי יחס המסה למטען שלהם (m/z), ובכך מגיעים לגלאי בזמנים שונים. עלילה של אות גלאי לעומת m/z מניבה ספקטרום מסה לאורגניזם שקשור באופן ייחודי להרכב הביוכימי שלו. השוואה של ספקטרום המסה לספרייה של ספקטרום התייחסות המתקבלת מניתוחים זהים של מיקרואורגניזמים ידועים מאפשרת זיהוי של החיידק הלא ידוע.
ניתן לזהות חיידקים גם על ידי מדידת פרופילי השומנים הייחודיים שלהם. כפי שלמדנו, חומצות שומן של שומנים יכולות להשתנות באורך השרשרת, נוכחות או היעדר קשרים כפולים, ומספר הקשרים הכפולים, קבוצות הידרוקסיל, ענפים וטבעות. כדי לזהות חיידק על ידי הרכב השומנים שלו, חומצות השומן הקיימות בממברנות שלהם מנותחות. ניתוח ביוכימי נפוץ המשמש למטרה זו הוא טכניקה המשמשת במעבדות קליניות, בריאות הציבור ומזון. הוא מסתמך על זיהוי הבדלים ייחודיים בחומצות שומן ונקרא ניתוח חומצות שומן מתיל אסטר (FAME). בניתוח FAME, חומצות שומן מופקות מממברנות המיקרואורגניזמים, משתנות כימית ליצירת אסטרים מתיל נדיפים, ומנותחות על ידי כרומטוגרפיית גז (GC). הכרומטוגרמה של GC המתקבלת מושווה לכרומטוגרמות ייחוס במסד נתונים המכיל נתונים עבור אלפי מבודדים חיידקיים לזיהוי המיקרואורגניזם הלא ידוע (איור). \(\PageIndex{2}\)
שיטה קשורה לזיהוי מיקרואורגניזם נקראת ניתוח חומצות שומן שמקורן בפוספוליפידים (PLFA). הממברנות מורכבות ברובן מפוספוליפידים, אותם ניתן לבצע סאפוניזציה (הידרוליזה עם אלקלי) כדי לשחרר את חומצות השומן. תערובת חומצות השומן המתקבלת נתונה לאחר מכן לניתוח FAME, וניתן להשוות את פרופילי השומנים הנמדדים לאלה של מיקרואורגניזמים ידועים כדי לזהות את המיקרואורגניזם הלא ידוע.
זיהוי חיידקי יכול להתבסס גם על החלבונים המיוצרים בתנאי גדילה ספציפיים בגוף האדם. סוגים אלה של הליכי זיהוי נקראים ניתוח פרוטאומי. כדי לבצע ניתוח פרוטאומי, חלבונים מהפתוגן מופרדים תחילה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC), ולאחר מכן מתעכלים השברים שנאספו כדי להניב שברי פפטיד קטנים יותר. פפטידים אלה מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה ומשווים לאלה של מיקרואורגניזמים ידועים כדי לזהות את המיקרואורגניזם הלא ידוע בדגימה המקורית.
ניתן לזהות מיקרואורגניזמים גם על ידי הפחמימות המחוברות לחלבונים (גליקופרוטאינים) בקרום הפלזמה או בדופן התא. נוגדנים וחלבונים אחרים המחייבים פחמימות יכולים להיצמד לפחמימות ספציפיות על משטחי התא, ולגרום לתאים להתקבץ יחד. בדיקות סרולוגיות (למשל, בדיקות קבוצות Lancefield, המשמשות לזיהוי מיני סטרפטוקוקוס) מבוצעות כדי לזהות את הפחמימות הייחודיות הממוקמות על פני התא.
מיקוד קליני: רזולוציה
פני הפסיקה להשתמש בקרם הגנה החדש שלה ומרחה את קרם הקורטיקוסטרואידים על הפריחה שלה לפי ההוראות. עם זאת, לאחר מספר ימים הפריחה שלה לא השתפרה ולמעשה נראה שהיא מחמירה. היא קבעה פגישת מעקב עם הרופא שלה, שראה פריחה אדומה גבשושית ושלפוחיות מלאות מוגלה סביב זקיקי השיער (איור). \(\PageIndex{3}\) הפריחה התרכזה במיוחד באזורים שהיו מכוסים בבגד ים. לאחר כמה תשאול, פני סיפרה לרופא שהיא השתתפה לאחרונה במסיבת בריכה ובילתה זמן מה בג'קוזי. לאור מידע חדש זה, חשד הרופא במקרה של פריחה בג'קוזי, זיהום הנגרם לעיתים קרובות על ידי החיידק Pseudomonas aeruginosa, פתוגן אופורטוניסטי שיכול לשגשג בג'קוזי ובבריכות שחייה, במיוחד כאשר המים אינם כלורים מספיק. P. aeruginosa הוא אותו חיידק הקשור לזיהומים בריאות של חולים עם סיסטיק פיברוזיס.
הרופא אסף דגימה מהפריחה של פני כדי להישלח למעבדה למיקרוביולוגיה קלינית. בוצעו בדיקות אישור כדי להבחין בין P. aeruginosa לבין פתוגנים אנטריים שיכולים להימצא גם במי בריכה וג'קוזי. הבדיקה כללה את הייצור של פיגמנט כחול ירוק pyocyanin על אגר cetrimide וצמיחה ב 42 מעלות צלזיוס Cetrimide הוא סוכן סלקטיבי המעכב את הצמיחה של מינים אחרים של צמחייה מיקרוביאלית וגם משפר את הייצור של P. aeruginosa פיגמנטים pyocyanin ו fluorescein, שהם מאפיין כחול-ירוק וצהוב-ירוק, בהתאמה.
בדיקות אישרו את נוכחותו של P. aeruginosa במדגם העור של פני, אך הרופא החליט לא לרשום אנטיביוטיקה. למרות P. aeruginosa הוא חיידק, מיני Pseudomonas עמידים בדרך כלל לאנטיביוטיקה רבים. למרבה המזל, דלקות עור כמו פני בדרך כלל מגבילות את עצמן; הפריחה נמשכת בדרך כלל כשבועיים ונפתרת מעצמה, עם או בלי טיפול רפואי. הרופא יעץ לפני להמתין ולהמשיך להשתמש בקרם הקורטיקוסטרואידים. הקרם לא יהרוג את P. aeruginosa על עורה של פני, אבל זה אמור להרגיע את הפריחה שלה ולמזער את הגירוד על ידי דיכוי התגובה הדלקתית של גופה לחיידקים.
מושגי מפתח וסיכום
- זיהוי מדויק של חיידקים חיוני במעבדה קלינית לאבחון וניהול של מגיפות, מגיפות והרעלת מזון הנגרמת כתוצאה מהתפרצויות חיידקים.
- הזיהוי הפנוטיפי של מיקרואורגניזמים כרוך בשימוש בתכונות הניתנות לצפייה, כולל פרופילים של רכיבים מבניים כגון שומנים, מוצרים ביו-סינתטיים כגון סוכרים או חומצות אמינו, או תרכובות אחסון כגון poly-β-hydroxybutyrate.
- חיידק לא ידוע עשוי להיות מזוהה מספקטרום המסה הייחודי המיוצר כאשר הוא מנותח על ידי זמן ספיחה/יינון בלייזר בסיוע מטריצה של ספקטרומטריית מסת טיסה (MALDI-TOF).
- ניתן לזהות חיידקים על ידי קביעת הרכב השומנים שלהם, באמצעות ניתוח חומצות שומן מתיל אסטרים (FAME) או חומצות שומן שמקורן בפוספוליפידים (PLFA).
- ניתוח פרוטאומי, המחקר של כל החלבונים המצטברים של אורגניזם, יכול לשמש גם לזיהוי חיידקים.
- גליקופרוטאינים בממברנת הפלזמה או במבני דופן התא יכולים להיקשר ללקטינים או נוגדנים וניתן להשתמש בהם לזיהוי.