8.10: עריכת גנום (CRISPR)

Last updated

Oct 31, 2023
Page ID
207803
Save as PDF
- 8.9: דאגה
- 8.11: מחשוף חלבון

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}$

פיתוח כלים שיאפשרו למדענים לבצע שינויים ספציפיים וממוקדים בגנום היה הגביע הקדוש של הביולוגיה המולקולרית. כלי חדש גאוני שהוא פשוט ויעיל בביצוע שינויים מדויקים עומד לחולל מהפכה בתחום, בדיוק כפי שעשה PCR בשנות השמונים. המכונה מערכת CRISPR/Cas9, ולעתים קרובות מקוצרת פשוט כ- CRISPR, היא מבוססת על מעין מערכת חיסונית חיידקית המאפשרת לחיידקים לזהות ולהשבית פולשים ויראליים.

CRSPR

CRISPR מייצג חזרות פלינדרומיות קצרות מקובצות באופן קבוע, רצפים קצרים חוזרים ונשנים שנמצאו ב- DNA פרוקריוטי, מופרדים על ידי רצפי מרווחים הנגזרים ממפגשים קודמים עם, למשל, בקטריופאג. בדומה לנעלי הזכוכית שהשאירה אחריה סינדרלה ששימשה מאוחר יותר לזיהויה, חלקי רצפי הפולש הם דרך לחיידקים לזהות את הנגיף אם הוא יתקוף שוב. מוכנסים לגנום החיידקי, ניתן לתמלל רצפים אלה מאוחר יותר ל-RNA מנחה התואם, וזוגות בסיסים עם, חלקים מהגנום הנגיפי אם הוא נתקל שוב. לאחר מכן נוקלאז הקשור ל-RNA המדריך מבקע את בסיס הרצף המשויך ל-RNA המדריך. (הגרעינים נקראים Cas על שם הקשורים ל- CRISPR.)

המרכיבים החיוניים של מערכת זו הם RNA מדריך המאכלס את רצף המטרה ונוקלאז שיכול לבצע חתך ברצף הקשור ל-RNA המדריך. על ידי RNAs מדריך הנדסי המשלימים לגן מטרה, ניתן לכוון את הגרעין להתבקע בתוך הגן הזה. במערכת CRISPR/Cas9, האנדונוקלאז Cas9 חותך את שני הגדילים של רצף הגנים הממוקדים על ידי ה- RNA המדריך (איור). $\PageIndex{1}$ זה יוצר הפסקה כפולה שהתא מנסה לתקן.

איור $\PageIndex{1}$ : מדריך RNA מכוון את נוקלאז Cas9 לגן המטרה שלו. תמונה על ידי פהר ג'ייקובסן

כפי שאתה אולי זוכר, ניתן לתקן שבירות כפולות ב-DNA על ידי חיבור קצה פשוט ולא הומולוגי (NHEJ) או על ידי רקומבינציה הומולוגית. כאשר הפסקה קבועה על ידי NHEJ, יש סיכוי טוב שיהיו מחיקות או הוספות שיבטלו את הגן בו הם נמצאים. לפיכך, מחשוף ממוקד של אתר על ידי CRISPR/Cas9 יכול להשבית גן בקלות ובאופן ספציפי, מה שמקל על אפיון תפקוד הגן.

אבל, מה אם תרצה פשוט לשנות את הגן באתר ספציפי כדי לחקור את השפעת המוטציה? גם את זה ניתן להשיג. אם מסופק רצף הומולוגי הנושא את המוטציה הספציפית, רקומבינציה הומולוגית יכולה לתקן את ההפסקה, ובמקביל להכניס את המוטציה המדויקת הרצויה. ברור שאם אתה יכול להכניס מוטציה כפי שתואר זה עתה, צריך להיות אפשרי לתקן מוטציה בגנום על ידי ביקוע במקום המתאים ומתן הרצף הנכון כתבנית לתיקון על ידי רקומבינציה הומולוגית. הפשטות של המערכת טומנת בחובה הבטחה גדולה לריפוי מחלות גנטיות.

מדענים העלו גם כמה וריאציות יצירתיות על מערכת CRISPR/Cas9. לדוגמה, גרסה אחת משביתה את פעילות הגרעין של Cas9. ה- RNA המדריך במערכת זו משתלב עם רצף המטרה, אך ה- Cas9 אינו מבקע אותו. במקום זאת, ה-Cas9 חוסם את השעתוק של הגן במורד הזרם (איור $\PageIndex{2}$ ) שיטה זו מאפשרת לכבות גנים ספציפיים מבלי לשנות את רצף ה-DNA בפועל.

איור $\PageIndex{2}$ : Cas9 לא פעיל יכול לחסום שעתוק של גן מטרה. תמונה על ידי פהר ג'ייקובסן

וריאציה אחרת משתמשת גם ב- Cas9 מושבת, אך הפעם, ה- Cas9 מתמזג לתחום הפעלה תעתיק. במצב זה, ה-RNA המדריך ממקם את תחום ה-Cas9-activator במקום שבו הוא יכול לשפר את השעתוק ממקדם ספציפי (איור). $\PageIndex{3}$ וריאציות אחרות בנושא זה מחברות אנזימים המשנים היסטון או מתילאזות DNA ל- Cas9 הלא פעיל. שוב, ה- RNA המדריך ממקם את ה- Cas9 במקום הרצוי, והאנזים המחובר ל- Cas9 יכול למתיל את ה- DNA או לשנות את ההיסטונים באזור זה.

איור $\PageIndex{3}$ : היתוך תחום מפעיל Cas9-יכול להפעיל שעתוק של גן מטרה. תמונה על ידי פהר ג'ייקובסן

CRISPR כבר שימש לעריכת גנומים במגוון רחב של מינים (ובתרביות תאים אנושיות). יתכן שלא יעבור זמן רב עד שהטכניקה תאושר לשימוש קליני. בינתיים, CRISPR משנה את הביולוגיה המולקולרית.