Skip to main content
Global

8.6: בידוד גנים

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    207790

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    מוקדם יותר בפרק זה, דנו בשיטות כגון כרומטוגרפיה של עמודות המשמשות לטיהור חלבונים בעלי עניין. באמצעות שילובים של שיטות אלה, ניתן לבודד חלבון לרמה גבוהה של טוהר, ובכך לאפשר לנו ללמוד את פעילות החלבון ותכונותיו. קשה יותר לפתור בעיה זו עבור חומצות גרעין. ניתן להשיג DNA גנומי בקלות מתאי, אך הוא מורכב מכדי לנתח אותו בכללותו. גנים בודדים הם יחידות ה- DNA המתאימות לחלבונים, ולכן הגיוני יותר לבודד גנים ספציפיים למחקר. שיטות לבידוד גנים לא היו זמינות עד שנות השבעים, כאשר גילוי אנזימי הגבלה והמצאת שיבוט מולקולרי סיפקו, לראשונה, דרכים להשיג כמויות גדולות של שברי DNA ספציפיים, למחקר. למרות שלמטרות השגת כמויות גדולות של שבר DNA ספציפי, שיבוט מולקולרי הוחלף במידה רבה בהגברה ישירה באמצעות תגובת שרשרת הפולימראז שתוארה מאוחר יותר, DNA משובט עדיין שימושי מאוד ממגוון סיבות. התפתחות השיבוט המולקולרי הייתה תלויה בגילוי אנדונוקליזות הגבלה, המתואר להלן.

    אנזימי הגבלה

    אנזימי הגבלה, או אנדונוקליזות הגבלה, הם אנזימים המיוצרים על ידי חיידקים. אנזימים אלה מגנים על חיידקים על ידי פירוק מולקולות DNA זרות הנישאות לתאים שלהם על ידי, למשל, בקטריופאג פולש. כל אנזים הגבלה מזהה רצף ספציפי, בדרך כלל של ארבעה או שישה נוקלאוטידים ב-DNA. רצפים אלה, כאשר הם מתרחשים ב- DNA של החיידק עצמו, משתנים כימית על ידי מתילציה, כך שהם לא מזוהים ומושפלים. כאשר רצפים אלה מתרחשים ב- DNA זר, הם נחתכים על ידי אנזים ההגבלה.

    התועלת והחשיבות של אנזימי הגבלה טמונה ביכולתם לזהות רצפים ספציפיים ב-DNA ולחתוך ליד או (בדרך כלל) באתר שהם מזהים. מעל 3000 אנזימים כאלה ידועים. רצפים המוכרים על ידי אנזימים אלה הם בדרך כלל באורך של 4-8 זוגות בסיסים והאנזימים הנפוצים ביותר מזהים רצפים המתוארים כפלינדרומיים.


    איור\(\PageIndex{1}\): -אנזים הגבלה הקשור לרצף הזיהוי שלו ב-DNA. ויקיפדיה

    פלינדרום

    בביולוגיה מולקולרית, המונח פלינדרום פירושו שרצף אתר הזיהוי כאשר הוא נקרא בכיוון 5' עד 3' עבור הגדיל העליון זהה לחלוטין לזה של הגדיל התחתון. שקול את הרצף המוכר על ידי אנזים ההגבלה המכונה הינד III (מבוטא hin-dee-3). זה

    5 'א-א-א-ג-ג-ט-ט-ט-3' 3'
    -ט-ט-ט-ג-ג-א-א-5'

    על הגדיל העליון, רצף הזיהוי הוא

    5 'גובה 3'

    שהוא זהה לחוט התחתון (קרא באותו כיוון 5' עד 3').

    בעוד שכל אנזימי ההגבלה חייבים לזהות ולהיקשר לרצפי DNA מסוימים, הנקודה המדויקת שבה הם חותכים את ה-DNA משתנה. חלק מהאנזימים משאירים רצף מדורג לאחר חיתוך שיש לו תלייה בקצה 5' של גדיל אחד של הדופלקס; חלקם משאירים רצף מדורג לאחר החיתוך שיש לו תלייה בקצה 3'; וחלקם חותכים את שני הגדילים באותו מקום, ולא משאירים רצף תלוי - הנקרא חותכי קצה בוטים.

    שקול לחתוך רצף DNA המכיל את אתר הזיהוי Hind III, כלומר

    5 'א-א-א-ג-ג-ט-ט-ט-3' 3'
    -ט-ט-ט-ג-ג-א-א-5'

    מוטבע בתוך רצף DNA, רצף ה- Hind III ייראה כך (Ns תואמים לכל בסיס ומייצגים את כל ה- DNA סביב אתר הזיהוי).

    5 '-נ-נ-נ-א-א-ג-ג-ט-ט-נ-נ-3' 3'
    -נ-נ--ט-ט-ג-ג-א-נ-נ-5'

    לאחר חיתוך עם הינד III, זה ייראה כך:

    5 '-נ-נ-נ-א 3' 5'א-ג-ג-ג-ט-ט-נ-נ-3' 3' -נ-נ-ט-ט-ק-ג-א-5' 3' א-נ-נ-נ-5'

    שם הוכנסו פערים כדי להמחיש היכן התרחש חיתוך. הינד III חותך בין שני הנוקלאוטידים המכילים 'A' ליד קצה 5' של רצף הזיהוי ובכך משאיר תליית 5' (איור). \(\PageIndex{2}\)


    איור\(\PageIndex{2}\): תוצאה של חיתוך DNA עם הינד III. ויקיפדיה

    אנזים ההגבלה Pst I, לעומת זאת, מזהה את הרצף הבא

    5 '-נ-נ-נ-ג-ג-ג-ג-א-נ-נ-נ-3' 3'
    -נ-נ-ג-א-ג-ג-ג-ג-נ-נ-נ-5'

    וחותך בין A ל- G ליד קצה 3' של רצף הזיהוי.

    5 '-נ-נ-נ-ג-ג-ג-ג-ג 3' 5'G-N-N-N 3' 3' -נ-נ-ג 5 '3' A-C-G-T-C-N-N-N 5'

    כפי שאתה יכול לראות, חיתוך DNA עם Pst I משאיר 3 'תליות של רצף הזיהוי. הקצוות שנותרו לאחר חיתוך על ידי אנזים הגבלה המשתלשלים בקצה 5' או בקצה 3' מכונים "דביקים" מכיוון שהם יכולים ליצור זוגות בסיס תקינים ולחבר אותם בקלות רבה יותר ל"קצה דביק" דומה. זה אומר שאתה יכול לקחת שתי חתיכות DNA לא קשורות, לחתוך אותן עם אותו אנזים הגבלה כך שיהיו להן קצוות דביקים תואמים, ואז "להדביק" אותן יחד באמצעות ליגאז DNA ליצירת מולקולה היברידית חדשה, או רקומביננטית.

    יצירת DNA רקומביננטי

    חיבור של שברי DNA ממקורות שונים יוצר DNA רקומביננטי. היכולת לחתוך ולהדביק DNA אולי נראית כמו הישג טכני גרידא, אך יישום מרכזי אחד שעלה מתוך זה הוא שיבוט מולקולרי. בשיבוט מולקולרי ניתן להכניס גן מעניין לווקטור, בדרך כלל פלסמיד, על ידי חיתוך הן של הווקטור והן של הגן (הנקרא הכנס) עם אותו אנזים ליצירת קצוות דביקים וחיבור שני החלקים יחד ליצירת רקומביננטי (איור). \(\PageIndex{3}\) פלסמיד הוא סוג של DNA משוכפל באופן אוטונומי, חוץ-כרומוזומלי. זה די פשוט לחלץ פלסמידים מהתאים, להנדס אותם כדי להכיל את הגן המעניין ולהכניס מחדש את הפלסמיד הרקומביננטי לחיידקים. הרעיון היה שכאשר ה-DNA הפלסמיד ישוכפל, גם הגן שהוכנס נוסף יועתק. לפיכך, על ידי גידול של הרבה מהחיידקים הנושאים את הפלסמיד, ניתן היה להשיג עותקים רבים של הגן המעניין, כדי לספק כמויות מספיקות של הגן לשימוש בניסויים. אמנם יש לנו כעת שיטות קלות יותר להשיג מטרה זו, אך DNA משובט נשאר שימושי מאוד. לדוגמה, ניתן לשבט גן המקודד לחלבון בעל עניין כך שניתן לבטא אותו ברמות גבוהות בתאים שאליהם מוכנס הפלסמיד הרקומביננטי.


    איור \(\PageIndex{3}\): בניית DNA רקומביננטי. ויקיפדיה

    לא משנה מה המטרה שלשמה נוצר הפלסמיד הרקומביננטי, הוא נושא בדרך כלל גן עמידות לאנטיביוטיקה (או גנים), הנקרא סמן לבחירה. תאים שתופסים את הפלסמיד יוכלו לצמוח בנוכחות האנטיביוטיקה. אם תאים חיידקיים שאליהם נוסף הפלסמיד מצופים על אגר המכיל את האנטיביוטיקה, התאים שתפסו את הפלסמיד יוכלו לצמוח, בעוד שהאחרים לא.

    איור\(\PageIndex{4}\): מפת אתר הגבלה עבור פלסמידים pUC 18/19, וקטור פלסמיד קלאסי. גנים שזוהו על ידי חיצים. המספרים תואמים את אמנת המספור PuC 18/19

    שיבוט ביטוי

    כפי שצוין לעיל, גן של עניין עשוי להיות מוכנס לתוך וקטור ואת הפלסמיד רקומביננטי להיות ממוקם לתוך תא שבו הגן יכול לבוא לידי ביטוי. לדוגמה, אפשר לרצות לשכפל את הגן המקודד להורמון גדילה אנושי או אינסולין או חלבונים חשובים מבחינה רפואית אחרים ולגרום לחיידק או שמרים לייצר כמויות גדולות ממנו בזול מאוד. זכרו שמדובר בחלבונים אנושיים, ולכן לא ניתן לחלץ את החלבונים בכמות כלשהי מנבדקים אנושיים.

    כדי לשכפל גן כך שהוא יכול לבוא לידי ביטוי, צריך להגדיר את התנאים המתאימים על מנת שהחלבון האנושי ייעשה בתאי החיידק. זה בדרך כלל כרוך בשימוש בפלסמידים שתוכננו במיוחד. פלסמידים אלה תוכננו ל- 1) לשכפל במספרים גבוהים; 2) לשאת סמנים המאפשרים לחוקרים לזהות תאים הנושאים אותם (עמידות לאנטיביוטיקה, למשל) ו -3) מכילים רצפים (כגון מקדם ורצף Shine Dalgarno) הנחוצים לביטוי החלבון הרצוי, עם אתרים נוחים להכנסת הגן המעניין במקום המתאים ביחס לרצפי הבקרה. פלסמיד שיש לו את כל התכונות הללו מכונה וקטור ביטוי. בנוסף לפלסמידים שניתן להשתמש בהם לביטוי בתאי חיידקים, קיימים גם וקטורי ביטוי המאפשרים ביטוי חלבון במגוון תאים אוקריוטיים.

    נוצרו וריאציות מתוחכמות רבות על וקטורים כאלה שהקלו על ייצור וטיהור כמויות גדולות של כל חלבון מעניין שעבורו הגן שובט. תכונה שימושית בכמה וקטורי ביטוי היא רצף המקודד לתג זיקה במעלה או במורד הזרם של הגן המתבטא. רצף זה מאפשר למזג תג זיקה קצר (כגון ריצה של שאריות היסטידין) על החלבון המקודד. התג יכול לשמש כדי לטהר בקלות את החלבון, כמתואר בסעיף על כרומטוגרפיה זיקה.