8: טכניקות בסיסיות
- Page ID
- 207717
\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)
סביבת התא מורכבת מאוד, מה שמקשה על לימוד תגובות בודדות, אנזימים או מסלולים באתרו. הגישה המסורתית בה משתמשים ביוכימאים לחקר הדברים הללו היא לבודד מולקולות, אנזימים, DNA, RNA ופריטים מעניינים אחרים, כך שניתן יהיה לנתח אותם ללא תלות במיליוני התהליכים האחרים המתרחשים בו זמנית. כיום, גישות אלה משמשות זו לצד זו עם שיטות חדשות יותר המאפשרות לנו להבין אירועים בתוך תאים בקנה מידה גדול יותר- למשל, קביעת כל הגנים המתבטאים בזמן נתון בתאים ספציפיים. בחלק זה נבחן בקצרה כמה שיטות נפוצות המשמשות לחקר מולקולות ביולוגיות ואינטראקציות ביניהן.
- 8.1: ליזת תאים
- כדי להפריד תרכובות מסביבות סלולריות, ראשית יש לפרוץ (ליזה) את התאים. תאים נשברים פתוחים, בתמיסות שנאגרו, כדי להשיג ליזאט. ישנן מספר דרכים להשיג זאת.
- 8.2: טכניקות חלוקה וכרומטוגרפיה
- חלוקה של דגימות, כפי שהשם מרמז, היא תהליך של הפרדת הרכיבים או השברים של הליזאט. חלוקה מתחילה בדרך כלל בצנטריפוגה של הליזאט. באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה, אפשר להסיר פסולת תאים, משאיר supernatant המכיל את התוכן של התא. על ידי שימוש במהירויות צנטריפוגה גבוהות יותר ברציפות (וכתוצאה מכך כוחות g) ניתן להפריד מרכיבים תאיים שונים, כמו גרעינים, מיטוכונדריה וכו ', מהציטופלזמה.
- 8.3: אלקטרופורזה
- אלקטרופורזה משתמשת בשדה חשמלי המופעל על פני מטריצת ג'ל כדי להפריד מולקולות גדולות כגון DNA, RNA וחלבונים לפי מטען וגודל. דגימות נטענות לבארות של מטריצת ג'ל שיכולה להפריד מולקולות לפי גודל ושדה חשמלי מוחל על פני הג'ל. שדה זה גורם למולקולות טעונות שלילי לנוע לעבר האלקטרודה החיובית. מטריצת הג'ל, עצמה, פועלת כמסננת, שדרכה עוברות המולקולות הקטנות ביותר במהירות, בעוד שמולקולות ארוכות יותר הן איטיות יותר
- 8.4: זיהוי, זיהוי וכימות של חומצות גרעין וחלבונים ספציפיים
- אחת הדרכים לזהות נוכחות של חומצת גרעין או חלבון מסוים תלויה בהעברת המולקולות המופרדות מהג'לים על קרום העשוי ניטרוצלולוזה או ניילון ליצירת "כתם" וחיטוט אחר המולקולה (ים) המעניינת באמצעות ריאגנטים הנקשרים באופן ספציפי לאותן מולקולות. החלק הבא ידון כיצד ניתן לעשות זאת עבור חומצות גרעין כמו גם עבור חלבונים.
- 8.5: טרנסקריפטומיה
- שקול מטריצה המכילה את כל רצפי הגנים הידועים בגנום. כדי ליצור מטריצה כזו לניתוח, יהיה צורך ליצור עותקים של כל גן, על ידי סינתזה כימית או באמצעות PCR. לאחר מכן יופרדו גדילי ה-DNA המתקבלים כדי להשיג רצפים חד-גדיליים שניתן לחבר לשבב. כל תיבה של הרשת תכיל רצף מגן אחד. אפשר לנתח את התעתיק - כל ה-mRNA שנעשים בתאים נבחרים בזמן נתון.
- 8.6: בידוד גנים
- שיטות לבידוד גנים לא היו זמינות עד שנות השבעים, כאשר גילוי אנזימי הגבלה והמצאת שיבוט מולקולרי סיפקו, לראשונה, דרכים להשיג כמויות גדולות של שברי DNA ספציפיים, למחקר. למרות שלמטרות השגת כמויות גדולות של שבר DNA ספציפי, שיבוט מולקולרי הוחלף במידה רבה בהגברה ישירה באמצעות תגובת שרשרת הפולימראז שתוארה מאוחר יותר, DNA משובט עדיין שימושי מאוד ממגוון סיבות.
- 8.7: תגובת שרשרת פולימראז (PCR)
- תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) מאפשרת להשתמש בכוח שכפול ה-DNA כדי להגביר את ה-DNA בצורה עצומה בפרק זמן קצר. כידוע, תאים משכפלים את ה- DNA שלהם לפני שהם מתחלקים, ובכך מכפילים את כמות ה- DNA של התא. PCR בעצם מחקה את שכפול ה-DNA הסלולרי במבחנה, מעתיק שוב ושוב את DNA המטרה, כדי לייצר כמויות גדולות של ה-DNA הרצוי.
- 8.8: תמלול הפוך
- בדוגמה המרכזית, DNA מקודד ל- mRNA, המקודד לחלבון. יוצא מן הכלל הידוע לדוגמה המרכזית מוצג על ידי רטרו-וירוסים. לנגיפים המקודדים ל-RNA הללו יש שלב במחזור החיים שלהם שבו ה-RNA הגנומי שלהם מומר בחזרה ל-DNA על ידי אנזים מקודד ויראלי המכונה טרנסקריפטאז הפוך. היכולת להמיר RNA ל- DNA היא שיטה רצויה במעבדה מסיבות רבות.
- 8.9: דאגה
- טכניקת העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) מבוססת על התצפית שמולקולה הנרגשת מספיגת האור יכולה להעביר אנרגיה למולקולה סמוכה אם ספקטרום הפליטה של המולקולה הראשונה חופף לספקטרום העירור של השנייה. העברת אנרגיה זו יכולה להתרחש רק אם שתי המולקולות קרובות מספיק זו לזו (לא יותר מכמה ננומטר זה מזה.
- 8.10: עריכת גנום (CRISPR)
- פיתוח כלים שיאפשרו למדענים לבצע שינויים ספציפיים וממוקדים בגנום היה הגביע הקדוש של הביולוגיה המולקולרית. כלי חדש גאוני שהוא פשוט ויעיל בביצוע שינויים מדויקים עומד לחולל מהפכה בתחום, בדיוק כפי שעשה PCR בשנות השמונים. המכונה מערכת CRISPR/Cas9, ולעתים קרובות מקוצרת פשוט כ- CRISPR, היא מבוססת על מעין מערכת חיסונית חיידקית המאפשרת לחיידקים לזהות ולהשבית פולשים ויראליים.
- 8.11: מחשוף חלבון
- בגלל גודלם הגדול, חלבונים שלמים יכולים להיות קשים ללימוד באמצעות טכניקות אנליטיות, כגון ספקטרומטריית מסה. כתוצאה מכך, לעתים קרובות רצוי לשבור פוליפפטיד גדול לחתיכות קטנות יותר. פרוטאזות הן אנזימים שבדרך כלל שוברים קשרים פפטידים על ידי קישור לרצפי חומצות אמינו ספציפיים בחלבון ומזרזים את ההידרוליזה שלהם.
- 8.12: דינמיקת ממברנה (FRAP)
- הבנת הדינמיקה של התנועה בממברנות התאים היא המחוז של טכניקת התאוששות הקרינה לאחר פוטו-הלבנה (FRAP). טכניקה אופטית זו משמשת למדידת דיפוזיה לרוחב דו מימדי של מולקולות בסרטים דקים, כמו ממברנות, באמצעות בדיקות שכותרתו פלואורסצנטית. יש לו גם יישומים בקשירת חלבון.
תמונה ממוזערת: כתם מערבי. תמונה בשימוש באישור (CC BY-SA 3.0; מגנוס מנסקה).