10.1: Cloning na Uhandisi wa Maumbile
- Page ID
- 173848
Bioteknolojia ni matumizi ya mbinu bandia kurekebisha nyenzo za maumbile ya viumbe hai au seli kuzalisha misombo ya riwaya au kutekeleza kazi mpya. Bioteknolojia imetumika kwa kuboresha mifugo na mazao tangu mwanzo wa kilimo kupitia uzalishaji wa kuchagua. Tangu ugunduzi wa muundo wa DNA mwaka 1953, na hasa tangu maendeleo ya zana na mbinu za kuendesha DNA katika miaka ya 1970, bioteknolojia imekuwa sawa na kudanganywa kwa DNA ya viumbe katika ngazi ya Masi. Matumizi ya msingi ya teknolojia hii ni katika dawa (kwa ajili ya uzalishaji wa chanjo na antibiotics) na katika kilimo (kwa mabadiliko ya maumbile ya mazao). Bioteknolojia pia ina matumizi mengi ya viwanda, kama vile fermentation, matibabu ya kumwagika mafuta, na uzalishaji wa nishati ya mimea, pamoja na maombi mengi ya kaya kama vile matumizi ya enzymes katika sabuni ya kufulia.
Kutumia vifaa vya maumbile
Ili kukamilisha maombi yaliyoelezwa hapo juu, biotechnologists lazima waweze kuchimba, kuendesha, na kuchambua asidi ya nucleic.
Mapitio ya Muundo wa Nucleic Acid
Ili kuelewa mbinu za msingi zinazotumiwa kufanya kazi na asidi za nucleic, kumbuka kwamba asidi ya nucleic ni macromolecules iliyofanywa kwa nucleotides (sukari, phosphate, na msingi wa nitrojeni). Makundi ya phosphate kwenye molekuli hizi kila mmoja yana malipo mabaya. Seti nzima ya molekuli za DNA katika kiini cha viumbe eukaryotiki huitwa jenomu. DNA ina vipande viwili vya ziada vinavyounganishwa na vifungo vya hidrojeni kati ya besi zilizounganishwa.
Tofauti na DNA katika seli za eukaryotiki, molekuli za RNA zinatoka kiini. Mtume RNA (mRNA) ni kuchambuliwa mara kwa mara kwa sababu inawakilisha jeni protini-coding kwamba ni kuwa walionyesha katika seli.
Kutengwa kwa asidi ya Nucleic
Ili kujifunza au kuendesha asidi za nucleic, DNA lazima kwanza iondokewe kwenye seli. Mbinu mbalimbali hutumiwa kuondoa aina tofauti za DNA (Kielelezo\(\PageIndex{1}\)). Mbinu nyingi za uchimbaji wa asidi ya nucleic zinahusisha hatua za kuvunja wazi kiini, na kisha matumizi ya athari za enzymatic kuharibu macromolecules zote zisizohitajika. Viini huvunjika wazi kwa kutumia suluhisho la sabuni iliyo na misombo ya buffering. Ili kuzuia uharibifu na uchafuzi, macromolecules kama vile protini na RNA hazipatikani kwa kutumia enzymes. DNA kisha huletwa nje ya suluhisho kwa kutumia pombe. DNA inayosababisha, kwa sababu imeundwa na polima ndefu, huunda molekuli ya gelatin.
RNA inasomewa kuelewa mifumo ya kujieleza jeni katika seli. RNA ni kawaida imara sana kwa sababu enzymes zinazovunja RNA huwa zipo katika asili. Baadhi hata hufichwa na ngozi yetu wenyewe na ni vigumu sana kuacha. Sawa na uchimbaji wa DNA, uchimbaji wa RNA unahusisha matumizi ya vizuizi na vimeng'enya mbalimbali ili kuzuia macromolecules nyingine na kuhifadhi RNA tu.
Gel Electrophoresis
Kwa sababu asidi ya nucleic ni ions kushtakiwa vibaya katika pH neutral au alkali katika mazingira yenye maji, zinaweza kuhamishwa na uwanja wa umeme. Gel electrophoresis ni mbinu inayotumiwa kutenganisha molekuli za kushtakiwa kwa misingi ya ukubwa na malipo. Asidi ya nucleic inaweza kutenganishwa kama chromosomes nzima au kama vipande. Asidi ya nucleic ni kubeba ndani ya slot mwisho mmoja wa tumbo la gel, sasa umeme hutumiwa, na molekuli za kushtakiwa vibaya hutolewa kuelekea mwisho wa gel (mwisho na electrode nzuri). Molekuli ndogo huhamia kupitia pores katika gel kwa kasi zaidi kuliko molekuli kubwa; tofauti hii katika kiwango cha uhamiaji hutenganisha vipande kwa misingi ya ukubwa. Asidi ya nucleic katika tumbo la gel hazionekani mpaka zimeharibiwa na kiwanja kinachowawezesha kuonekana, kama vile rangi. Vipande tofauti vya asidi ya nucleic vinaonekana kama bendi katika umbali maalum kutoka juu ya gel (mwisho wa electrode hasi) ambayo inategemea ukubwa wao (Kielelezo\(\PageIndex{2}\)). Mchanganyiko wa vipande vingi vya ukubwa tofauti huonekana kama smear ndefu, ilhali DNA ya genomic isiyokatwa kwa kawaida ni kubwa mno ili kukimbia kupitia gel na huunda bendi moja kubwa juu ya gel.
Polymerase mnyororo mmenyuko
Uchambuzi wa DNA mara nyingi unahitaji kulenga mikoa moja au zaidi maalum ya jenomu. Pia mara nyingi huhusisha hali ambazo nakala moja tu au chache za molekuli ya DNA zinapatikana kwa uchambuzi zaidi. Kiasi hiki haitoshi kwa taratibu nyingi, kama vile electrophoresis ya gel. Polymerase mnyororo mmenyuko (PCR) ni mbinu inayotumika kuongeza kasi idadi ya nakala za mikoa maalum ya DNA kwa ajili ya uchambuzi zaidi (Kielelezo\(\PageIndex{3}\)). PCR inatumia aina maalum ya DNA polimerasi, enzyme inayoiga DNA, na utaratibu mwingine mfupi wa nucleotidi unaoitwa primers kwamba jozi ya msingi kwa sehemu maalum ya DNA inayoigwa. PCR hutumiwa kwa madhumuni mengi katika maabara. Hizi ni pamoja na: 1) utambulisho wa mmiliki wa sampuli ya DNA iliyoachwa kwenye eneo la uhalifu; 2) uchambuzi wa ubaba; 3) kulinganisha kiasi kidogo cha DNA ya kale na viumbe vya kisasa; na 4) kuamua mlolongo wa nucleotides katika eneo fulani.
Cloning
Kwa ujumla, cloning ina maana ya kuundwa kwa replica kamili. Kwa kawaida, neno hutumiwa kuelezea uumbaji wa nakala inayofanana na jeni. Katika biolojia, uumbaji upya wa viumbe vyote hujulikana kama “cloning ya uzazi.” Muda mrefu kabla ya majaribio yalifanywa kuunganisha viumbe vyote, watafiti walijifunza jinsi ya kunakili short stretches ya DNA-mchakato ambayo inajulikana kama cloning Masi.
Cloning ya Masi
Cloning inaruhusu kuundwa kwa nakala nyingi za jeni, usemi wa jeni, na kujifunza jeni maalum. Ili kupata kipande cha DNA ndani ya kiini cha bakteria kwa fomu ambayo itakiliwa au imeelezwa, kipande kinaingizwa kwanza kwenye plasmid. Plasmid (pia huitwa vector katika muktadha huu) ni molekuli ndogo ya DNA ya mviringo inayoiga kwa kujitegemea DNA ya kromosomu katika bakteria. Katika cloning, molekuli ya plasmid inaweza kutumika kutoa “gari” ambalo linaingiza kipande cha DNA kilichohitajika. Plasmidi iliyobadilishwa kwa kawaida huingizwa tena katika jeshi la bakteria kwa ajili ya kuiga. Kama bakteria hugawanyika, huchapisha DNA yao wenyewe (ikiwa ni pamoja na plasmidi). Kipande cha DNA kilichoingizwa kinakiliwa pamoja na DNA iliyobaki ya bakteria. Katika seli ya bakteria, kipande cha DNA kutoka jenomu ya binadamu (au kiumbe kingine kinachosomwa) kinajulikana kama DNA ya kigeni ili kuitofautisha na DNA ya bakteria (DNA ya jeshi).
Plasmidi hutokea kiasili katika wakazi wa bakteria (kama vile Escherichia coli) na huwa na jeni zinazoweza kuchangia sifa nzuri kwa viumbe, kama vile upinzani wa antibiotiki (uwezo wa kutoathiriwa na antibiotics). Plasmidi imekuwa sana engineered kama wadudu kwa cloning Masi na kwa ajili ya uzalishaji baadae kwa kiasi kikubwa cha molekuli muhimu, kama vile insulini. Tabia muhimu ya vectors ya plasmid ni urahisi ambao kipande cha DNA cha kigeni kinaweza kuletwa. Vectors hizi za plasmid zina Utaratibu mfupi wa DNA ambazo zinaweza kukatwa na enzymes tofauti za kizuizi zinazopatikana kwa kawaida. Enzymes za kizuizi (pia huitwa kizuizi endonucleases) hutambua utaratibu maalum wa DNA na kuzikatwa kwa namna ya kutabirika; kwa kawaida huzalishwa na bakteria kama utaratibu wa ulinzi dhidi ya DNA ya kigeni. Enzymes nyingi za kizuizi hufanya kupunguzwa kwa kasi katika vipande viwili vya DNA, kama vile mwisho wa kukata una overhang ya 2- hadi 4-nucleotide moja iliyopigwa. Mlolongo unaotambuliwa na enzyme ya kizuizi ni mlolongo wa nucleotide nne hadi nane ambayo ni palindrome. Kama kwa neno palindrome, hii ina maana mlolongo anayesoma sawa mbele na nyuma. Katika hali nyingi, mlolongo unasoma sawa mbele ya kamba moja na nyuma kwenye kamba ya ziada. Wakati kukata kwa mchanganyiko kunafanywa kwa mlolongo kama huu, overhangs ni ziada (Kielelezo\(\PageIndex{4}\)).
Kwa sababu overhangs hizi zina uwezo wa kurudi pamoja na kuunganisha hidrojeni na overhangs ya ziada kwenye kipande cha DNA iliyokatwa na enzyme sawa ya kizuizi, haya huitwa “mwisho wa nata.” Mchakato wa kutengeneza vifungo vya hidrojeni kati ya utaratibu wa ziada juu ya vipande moja ili kuunda DNA mbili-stranded inaitwa annealing. Kuongezewa kwa enzyme inayoitwa DNA ligase, ambayo inashiriki katika replication ya DNA katika seli, hujiunga kabisa na vipande vya DNA wakati ncha za nata zinakusanyika. Kwa njia hii, kipande chochote cha DNA kinaweza kugawanywa kati ya mwisho wa DNA ya plasmid ambayo imekatwa na enzyme sawa ya kizuizi (Kielelezo\(\PageIndex{5}\)).
Plasmidi yenye DNA ya kigeni iliyoingizwa ndani yao huitwa molekuli za DNA za recombinant kwa sababu zina mchanganyiko mpya wa vifaa vya maumbile. Protini zinazozalishwa kutoka kwa molekuli za DNA za recombinant huitwa protini za recombinant. Sio plasmidi zote za recombinant zina uwezo wa kueleza jeni. Plasmidi pia inaweza kuwa engineered kueleza protini tu wakati drivas na mambo fulani ya mazingira, ili wanasayansi wanaweza kudhibiti usemi wa protini recombinant.
Cloning ya uzazi
Cloning ya uzazi ni njia inayotumiwa kufanya clone au nakala inayofanana ya viumbe vyote vya multicellular. Viumbe vingi vya seli nyingi hupata uzazi kwa njia ya ngono, ambayo inahusisha mchango wa DNA kutoka kwa watu wawili (wazazi), na kuifanya haiwezekani kuzalisha nakala inayofanana au kiungo cha mzazi aidha. Maendeleo ya hivi karibuni katika bioteknolojia yamefanya hivyo inawezekana kwa uzazi clone mamalia katika maabara.
Uzazi wa kijinsia wa asili unahusisha umoja, wakati wa mbolea, ya mbegu na yai. Kila moja ya gameti hizi ni haploidi, maana zina seti moja ya chromosomes katika viini vyao. Kiini kinachosababisha, au zygote, ni kisha diploid na ina seti mbili za chromosomes. Kiini hiki hugawanya mitotically kuzalisha viumbe vingi. Hata hivyo, muungano wa seli zozote mbili tu hawezi kuzalisha zygote inayofaa; kuna vipengele katika saitoplazimu ya seli ya yai ambayo ni muhimu kwa maendeleo mapema ya kiinitete wakati wa mgawanyiko wake wa kwanza wa seli chache. Bila masharti haya, hakutakuwa na maendeleo ya baadaye. Kwa hiyo, ili kuzalisha mtu mpya, inayosaidia maumbile ya diploid na cytoplasm ya yai inahitajika. Njia ya kuzalisha mtu binafsi ya kibinafsi ni kuchukua kiini cha yai cha mtu mmoja na kuondoa kiini cha haploid. Kisha kiini cha diploid kutoka kiini cha mwili cha mtu wa pili, wafadhili, huwekwa kwenye kiini cha yai. Kisha yai huchochewa kugawanya ili maendeleo yaweke. Hii inaonekana rahisi, lakini kwa kweli inachukua majaribio mengi kabla ya kila hatua kukamilika kwa mafanikio.
Mnyama wa kilimo wa kwanza wa cloned alikuwa Dolly, kondoo aliyezaliwa mwaka 1996. Kiwango cha mafanikio ya cloning ya uzazi wakati huo kilikuwa cha chini sana. Dolly aliishi kwa miaka sita na alikufa kwa tumor ya mapafu (Kielelezo\(\PageIndex{6}\)). Kulikuwa na uvumi kwamba kwa sababu DNA ya seli iliyosababisha Dolly ilitoka kwa mtu mzee, umri wa DNA huenda umeathiri matarajio yake ya maisha. Tangu Dolly, spishi kadhaa za wanyama (kama vile farasi, ng'ombe, na mbuzi) zimefanikiwa kuunganishwa.
Kumekuwa na majaribio ya kuzalisha majusi ya binadamu yaliyopigwa kama vyanzo vya seli za shina za embryonic. Katika utaratibu, DNA kutoka kwa mwanadamu mzima huletwa ndani ya kiini cha yai cha binadamu, ambacho huchochewa kugawa. Teknolojia hiyo ni sawa na teknolojia ambayo ilitumiwa kuzalisha Dolly, lakini kiinitete hajawahi kuingizwa ndani ya mama ya kizazi. Seli zinazozalishwa huitwa seli za shina za embryonic kwa sababu zina uwezo wa kuendeleza kuwa aina nyingi za seli, kama vile seli za misuli au neva. Seli za shina zinaweza kutumika kwa utafiti na hatimaye kutoa maombi ya matibabu, kama vile kuondoa tishu zilizoharibiwa. Faida ya cloning katika mfano huu ni kwamba seli kutumika regenerate tishu mpya itakuwa mechi kamili kwa wafadhili wa DNA awali. Kwa mfano, mgonjwa wa leukemia hakutaka ndugu na mechi ya tishu kwa kupandikiza mfupa wa mfupa.
UHUSIANO WA S
Kwa nini Dolly Finn-Dorset na si Scottish Blackface kondoo?
Maumbile Engineer
Kutumia teknolojia ya DNA ya recombinant kurekebisha DNA ya kiumbe ili kufikia sifa za kuhitajika huitwa uhandisi wa maumbile. Kuongezewa kwa DNA ya kigeni kwa namna ya vectors ya DNA ya recombinant ambayo yanazalishwa na cloning ya Masi ni njia ya kawaida ya uhandisi wa maumbile. Kiumbe kinachopokea DNA ya recombinant huitwa viumbe vinasaba (GMO). Ikiwa DNA ya kigeni inayoanzishwa inatokana na spishi tofauti, kiumbe cha jeshi kinaitwa transgenic. Bakteria, mimea, na wanyama wamebadilishwa vinasaba tangu mwanzoni mwa miaka ya 1970 kwa madhumuni ya kitaaluma, matibabu, kilimo, na viwanda. Maombi haya yatazingatiwa kwa undani zaidi katika moduli inayofuata.
DHANA KATIKA HATUA
Tazama video hii fupi inayoelezea jinsi wanasayansi wanavyounda mnyama wa transgenic.
Ingawa mbinu za kikabila za kusoma kazi ya jeni zilianza na fenotype iliyotolewa na kuamua msingi wa maumbile wa fenotype hiyo, mbinu za kisasa zinaruhusu watafiti kuanza katika ngazi ya mlolongo wa DNA na kuuliza: “Jeni hii au kipengele cha DNA hufanya nini?” Mbinu hii, inayoitwa reverse genetics, imesababisha kugeuza mbinu classical maumbile. Mfano mmoja wa njia hii ni sawa na kuharibu sehemu ya mwili ili kuamua kazi yake. Mdudu unaopoteza mrengo hauwezi kuruka, maana yake kazi ya mrengo ni kukimbia. Njia ya maumbile ya kikabila inalinganisha wadudu wasioweza kuruka na wadudu wanaoweza kuruka, na huona ya kwamba wadudu wasio kuruka wamepoteza mabawa. Vile vile katika mbinu reverse genetics, mutating au kufuta jeni hutoa watafiti na dalili kuhusu kazi jeni. Vinginevyo, reverse genetics inaweza kutumika kusababisha jeni overexpress yenyewe kuamua nini madhara phenotypic yanaweza kutokea.
Muhtasari
Asidi za nucleic zinaweza kutengwa na seli kwa madhumuni ya uchambuzi zaidi kwa kuvunja wazi seli na kuharibu enzymatically macromolecules nyingine zote kuu. Chromosomes iliyogawanyika au nzima inaweza kutengwa kwa misingi ya ukubwa na electrophoresis ya gel. Vipande vifupi vya DNA vinaweza kupanuliwa na PCR. DNA inaweza kukatwa (na hatimaye kuunganishwa pamoja) kwa kutumia enzymes za kizuizi. Mbinu za molekuli na za mkononi za bioteknolojia huruhusu watafiti kuunda viumbe vya uhandisi, kurekebisha ili kufikia sifa zinazohitajika.
Cloning inaweza kuhusisha cloning vipande vidogo vya DNA (cloning ya Masi), au cloning viumbe vyote (cloning ya uzazi). Katika cloning ya Masi na bakteria, kipande cha DNA kinachohitajika kinaingizwa kwenye plasmid ya bakteria kwa kutumia enzymes za kizuizi na plasmid inachukuliwa na bakteria, ambayo itaelezea DNA ya kigeni. Kutumia mbinu nyingine, jeni za kigeni zinaweza kuingizwa katika viumbe vya eukaryotiki. Katika kila kesi, viumbe huitwa viumbe vya transgenic. Katika cloning ya uzazi, kiini cha wafadhili kinawekwa kwenye kiini cha yai kilichowekwa, ambacho kinachochewa kugawanya na kuendeleza kuwa kiumbe.
Katika mbinu za jenetiki za reverse, jeni hubadilika au kuondolewa kwa namna fulani ili kutambua athari zake kwenye phenotype ya viumbe vyote kama njia ya kuamua kazi yake.
Sanaa Connections
Kielelezo\(\PageIndex{6}\): Kwa nini Dolly Finn-Dorset na si Scottish Blackface kondoo?
- Jibu
-
Kwa sababu ingawa kiini cha awali kilikuja kutoka kondoo wa Blackface wa Scottish na mama huyo alikuwa Blackface ya Scottish, DNA ilitoka kwa Finn-Dorset.
faharasa
- anneal
- katika biolojia ya Masi, mchakato ambao vipande viwili vya dhamana ya hidrojeni ya DNA katika nyukleotidi za ziada ili kuunda molekuli ya mara mbili
- bioteknolojia
- matumizi ya mbinu bandia kurekebisha vifaa vya maumbile ya viumbe hai au seli kuzalisha misombo riwaya au kufanya kazi mpya
- upachishaji
- uzalishaji wa nakala halisi-hasa, halisi maumbile nakala-ya jeni, kiini, au viumbe
- gel electrophoresis
- mbinu inayotumiwa kutenganisha molekuli kwa misingi ya uwezo wao wa kuhamia kupitia gel semisolid kwa kukabiliana na sasa umeme
- uhandisi maumbile
- mabadiliko ya babies maumbile ya viumbe kwa kutumia mbinu Masi ya bioteknolojia
- vinasaba viumbe (GMO)
- kiumbe ambao genome imekuwa artificially iliyopita
- plasmid
- molekuli ndogo ya mviringo ya DNA inayopatikana katika bakteria inayoiga kwa kujitegemea kromosomu kuu ya bakteria; msimbo wa plasmidi kwa baadhi ya sifa muhimu kwa bakteria na inaweza kutumika kama wadudu kusafirisha DNA ndani ya bakteria katika maombi ya uhandisi wa maumbile
- polymerase mnyororo mmenyuko (PCR)
- mbinu inayotumika kufanya nakala nyingi za DNA
- DNA inayounganishwa tena
- mchanganyiko wa vipande vya DNA vinavyotokana na cloning ya Masi ambayo haipo katika asili
- protini recombinant
- protini kwamba ni walionyesha kutoka molekuli recombinant DNA
- kuzuia enzyme
- enzyme ambayo inatambua mlolongo maalum wa nucleotide katika DNA na kupunguzwa kamba ya DNA mara mbili kwenye tovuti hiyo ya kutambua, mara nyingi kwa kukata kwa kukataa kuacha vipande vifupi au “nata” mwisho
- genetics ya nyuma
- aina ya uchambuzi wa maumbile ambayo hutumia DNA kuvuruga au kuathiri bidhaa za jeni kuchambua kazi ya jeni
- cloning ya uzazi
- cloning ya viumbe vyote
- jeni kutoka mnyama mwingine
- kuelezea viumbe kwamba anapata DNA kutoka aina mbalimbali