10.1 : Clonage et génie génétique
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La biotechnologie consiste à utiliser des méthodes artificielles pour modifier le matériel génétique d'organismes ou de cellules vivants afin de produire de nouveaux composés ou de remplir de nouvelles fonctions. La biotechnologie a été utilisée pour améliorer le bétail et les cultures depuis le début de l'agriculture grâce à la sélection sélective. Depuis la découverte de la structure de l'ADN en 1953, et en particulier depuis le développement d'outils et de méthodes de manipulation de l'ADN dans les années 1970, la biotechnologie est devenue synonyme de manipulation de l'ADN des organismes au niveau moléculaire. Les principales applications de cette technologie se situent en médecine (pour la production de vaccins et d'antibiotiques) et en agriculture (pour la modification génétique des cultures). La biotechnologie a également de nombreuses applications industrielles, telles que la fermentation, le traitement des déversements d'hydrocarbures et la production de biocarburants, ainsi que de nombreuses applications domestiques telles que l'utilisation d'enzymes dans les détergents à lessive.
Manipulation du matériel génétique
Pour réaliser les applications décrites ci-dessus, les biotechnologues doivent être en mesure d'extraire, de manipuler et d'analyser les acides nucléiques.
Examen de la structure des acides nucléiques
Pour comprendre les techniques de base utilisées pour travailler avec les acides nucléiques, rappelez-vous que les acides nucléiques sont des macromolécules constituées de nucléotides (un sucre, un phosphate et une base azotée). Les groupes phosphates de ces molécules ont chacun une charge négative nette. Le génome est un ensemble complet de molécules d'ADN présentes dans le noyau des organismes eucaryotes. L'ADN possède deux brins complémentaires liés par des liaisons hydrogène entre les bases appariées.
Contrairement à l'ADN des cellules eucaryotes, les molécules d'ARN quittent le noyau. L'ARN messager (ARNm) est analysé le plus fréquemment parce qu'il représente les gènes codant pour les protéines qui sont exprimés dans la cellule.
Isolement des acides nucléiques
Pour étudier ou manipuler les acides nucléiques, l'ADN doit d'abord être extrait des cellules. Différentes techniques sont utilisées pour extraire différents types d'ADN (Figure\(\PageIndex{1}\)). La plupart des techniques d'extraction d'acides nucléiques impliquent des étapes pour ouvrir la cellule, puis l'utilisation de réactions enzymatiques pour détruire toutes les macromolécules indésirables. Les cellules sont ouvertes à l'aide d'une solution détergente contenant des substances tampons. Pour prévenir la dégradation et la contamination, les macromolécules telles que les protéines et l'ARN sont inactivées à l'aide d'enzymes. L'ADN est ensuite extrait de la solution à l'aide d'alcool. L'ADN qui en résulte, parce qu'il est composé de longs polymères, forme une masse gélatineuse.
L'ARN est étudié pour comprendre les modèles d'expression génique dans les cellules. L'ARN est naturellement très instable car les enzymes qui le décomposent sont couramment présentes dans la nature. Certains sont même sécrétés par notre peau et sont très difficiles à inactiver. À l'instar de l'extraction de l'ADN, l'extraction de l'ARN implique l'utilisation de divers tampons et enzymes pour inactiver d'autres macromolécules et ne conserver que l'ARN.
Électrophorèse sur gel
Comme les acides nucléiques sont des ions chargés négativement à un pH neutre ou alcalin dans un environnement aqueux, ils peuvent être déplacés par un champ électrique. L'électrophorèse sur gel est une technique utilisée pour séparer les molécules chargées en fonction de leur taille et de leur charge. Les acides nucléiques peuvent être séparés sous forme de chromosomes entiers ou de fragments. Les acides nucléiques sont chargés dans une fente à une extrémité d'une matrice de gel, un courant électrique est appliqué et les molécules chargées négativement sont tirées vers l'extrémité opposée du gel (l'extrémité avec l'électrode positive). Les petites molécules se déplacent à travers les pores du gel plus rapidement que les molécules plus grosses ; cette différence de vitesse de migration sépare les fragments en fonction de leur taille. Les acides nucléiques d'une matrice de gel sont invisibles jusqu'à ce qu'ils soient colorés avec un composé qui permet de les voir, tel qu'un colorant. Des fragments distincts d'acides nucléiques apparaissent sous forme de bandes situées à des distances spécifiques du sommet du gel (extrémité de l'électrode négative), en fonction de leur taille (Figure\(\PageIndex{2}\)). Un mélange de nombreux fragments de différentes tailles apparaît sous la forme d'un long frottis, alors que l'ADN génomique non découpé est généralement trop gros pour traverser le gel et forme une seule grande bande au sommet du gel.
réaction en chaîne par polymérase
L'analyse de l'ADN nécessite souvent de se concentrer sur une ou plusieurs régions spécifiques du génome. Cela implique également fréquemment des situations dans lesquelles seules une ou quelques copies d'une molécule d'ADN sont disponibles pour une analyse plus approfondie. Ces quantités sont insuffisantes pour la plupart des procédures, telles que l'électrophorèse sur gel. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique utilisée pour augmenter rapidement le nombre de copies de régions spécifiques de l'ADN en vue d'analyses ultérieures (Figure\(\PageIndex{3}\)). La PCR utilise une forme spéciale d'ADN polymérase, l'enzyme qui réplique l'ADN, et d'autres courtes séquences nucléotidiques appelées amorces qui s'associent à une partie spécifique de l'ADN répliqué. La PCR est utilisée à de nombreuses fins dans les laboratoires. Il s'agit notamment de : 1) l'identification du propriétaire d'un échantillon d'ADN laissé sur les lieux d'un crime ; 2) une analyse de paternité ; 3) la comparaison de petites quantités d'ADN ancien avec des organismes modernes ; et 4) la détermination de la séquence des nucléotides dans une région spécifique.
Clonage
En général, le clonage signifie la création d'une réplique parfaite. Généralement, le mot est utilisé pour décrire la création d'une copie génétiquement identique. En biologie, la recréation d'un organisme entier est appelée « clonage reproductif ». Bien avant de tenter de cloner un organisme entier, les chercheurs ont appris à copier de courtes portions d'ADN, un processus connu sous le nom de clonage moléculaire.
Clonage moléculaire
Le clonage permet la création de multiples copies de gènes, l'expression de gènes et l'étude de gènes spécifiques. Pour introduire le fragment d'ADN dans une cellule bactérienne sous une forme qui sera copiée ou exprimée, le fragment est d'abord inséré dans un plasmide. Un plasmide (également appelé vecteur dans ce contexte) est une petite molécule d'ADN circulaire qui se réplique indépendamment de l'ADN chromosomique des bactéries. Lors du clonage, les molécules plasmidiques peuvent être utilisées pour fournir un « véhicule » dans lequel insérer un fragment d'ADN souhaité. Les plasmides modifiés sont généralement réintroduits dans un hôte bactérien à des fins de réplication. À mesure que les bactéries se divisent, elles copient leur propre ADN (y compris les plasmides). Le fragment d'ADN inséré est copié avec le reste de l'ADN bactérien. Dans une cellule bactérienne, le fragment d'ADN du génome humain (ou d'un autre organisme étudié) est appelé ADN étranger afin de le différencier de l'ADN de la bactérie (l'ADN de l'hôte).
Les plasmides sont naturellement présents dans les populations bactériennes (comme Escherichia coli) et possèdent des gènes qui peuvent apporter des caractéristiques favorables à l'organisme, telles que la résistance aux antibiotiques (capacité de ne pas être affectés par les antibiotiques). Les plasmides ont été hautement modifiés en tant que vecteurs pour le clonage moléculaire et pour la production ultérieure à grande échelle de molécules importantes, telles que l'insuline. Une caractéristique intéressante des vecteurs plasmidiques est la facilité avec laquelle un fragment d'ADN étranger peut être introduit. Ces vecteurs plasmidiques contiennent de nombreuses courtes séquences d'ADN qui peuvent être coupées à l'aide de différentes enzymes de restriction couramment disponibles. Les enzymes de restriction (également appelées endonucléases de restriction) reconnaissent des séquences d'ADN spécifiques et les coupent de manière prévisible ; elles sont produites naturellement par les bactéries comme mécanisme de défense contre l'ADN étranger. De nombreuses enzymes de restriction effectuent des coupes échelonnées dans les deux brins d'ADN, de telle sorte que les extrémités coupées présentent un surplomb monocaténaire de 2 à 4 nucléotides. La séquence reconnue par l'enzyme de restriction est une séquence de quatre à huit nucléotides qui est un palindrome. Comme pour un mot palindrome, cela signifie que la séquence se lit de la même manière en avant et en arrière. Dans la plupart des cas, la séquence se lit de la même façon en avant sur un brin et en arrière sur le brin complémentaire. Lorsqu'une découpe en quinconce est réalisée dans une séquence comme celle-ci, les surplombs sont complémentaires (Figure\(\PageIndex{4}\)).
Comme ces surplombs sont capables de se réassembler par liaison hydrogène avec des surplombs complémentaires sur un morceau d'ADN découpé avec la même enzyme de restriction, on les appelle « extrémités collantes ». Le processus de formation de liaisons hydrogène entre des séquences complémentaires sur des brins simples pour former de l'ADN double brin est appelé recuit. L'ajout d'une enzyme appelée ADN ligase, qui participe à la réplication de l'ADN dans les cellules, joint définitivement les fragments d'ADN lorsque les extrémités collantes se rejoignent. De cette manière, n'importe quel fragment d'ADN peut être épissé entre les deux extrémités d'un ADN plasmidique découpé avec la même enzyme de restriction (Figure\(\PageIndex{5}\)).
Les plasmides dans lesquels de l'ADN étranger est inséré sont appelés molécules d'ADN recombinant parce qu'ils contiennent de nouvelles combinaisons de matériel génétique. Les protéines produites à partir de molécules d'ADN recombinant sont appelées protéines recombinantes. Tous les plasmides recombinants ne sont pas capables d'exprimer des gènes. Les plasmides peuvent également être modifiés pour exprimer des protéines uniquement lorsqu'ils sont stimulés par certains facteurs environnementaux, afin que les scientifiques puissent contrôler l'expression des protéines recombinantes.
Clonage reproductif
Le clonage reproductif est une méthode utilisée pour créer un clone ou une copie identique d'un organisme multicellulaire entier. La plupart des organismes multicellulaires se reproduisent par voie sexuelle, ce qui implique l'apport d'ADN de deux individus (parents), ce qui rend impossible la génération d'une copie identique ou d'un clone de l'un ou l'autre des parents. Les récents progrès de la biotechnologie ont permis de cloner des mammifères de manière reproductrice en laboratoire.
La reproduction sexuelle naturelle implique l'union, lors de la fécondation, d'un spermatozoïde et d'un ovule. Chacun de ces gamètes est haploïde, c'est-à-dire qu'ils contiennent un ensemble de chromosomes dans leur noyau. La cellule résultante, ou zygote, est alors diploïde et contient deux ensembles de chromosomes. Cette cellule se divise par mitose pour produire un organisme multicellulaire. Cependant, l'union de deux cellules quelconques ne peut pas produire de zygote viable ; certains composants du cytoplasme de l'ovule sont essentiels au développement précoce de l'embryon au cours de ses premières divisions cellulaires. Sans ces dispositions, il n'y aurait pas de développement ultérieur. Par conséquent, pour produire un nouvel individu, il faut à la fois un complément génétique diploïde et un cytoplasme d'ovule. L'approche pour produire un individu cloné artificiellement consiste à prélever l'ovule d'un individu et à retirer le noyau haploïde. Ensuite, un noyau diploïde provenant d'une cellule du corps d'un deuxième individu, le donneur, est introduit dans l'ovule. L'œuf est ensuite stimulé pour se diviser afin que le développement se poursuive. Cela semble simple, mais en fait, il faut de nombreuses tentatives avant que chacune des étapes ne soit terminée avec succès.
Le premier animal agricole cloné était Dolly, une brebis née en 1996. Le taux de réussite du clonage reproductif à l'époque était très faible. Dolly a vécu six ans et est décédée d'une tumeur au poumon (Figure\(\PageIndex{6}\)). Certains ont émis l'hypothèse que, comme l'ADN cellulaire à l'origine de Dolly provenait d'une personne plus âgée, l'âge de l'ADN aurait pu affecter son espérance de vie. Depuis Dolly, plusieurs espèces d'animaux (chevaux, taureaux et chèvres) ont été clonées avec succès.
Des tentatives ont été faites pour produire des embryons humains clonés comme sources de cellules souches embryonnaires. Au cours de la procédure, l'ADN d'un humain adulte est introduit dans un ovule humain, qui est ensuite stimulé pour se diviser. La technologie est similaire à celle qui a été utilisée pour produire Dolly, mais l'embryon n'est jamais implanté chez une mère porteuse. Les cellules produites sont appelées cellules souches embryonnaires parce qu'elles ont la capacité de se développer en de nombreux types de cellules, telles que des cellules musculaires ou nerveuses. Les cellules souches pourraient être utilisées pour la recherche et, à terme, fournir des applications thérapeutiques, telles que le remplacement de tissus endommagés. L'avantage du clonage dans ce cas est que les cellules utilisées pour régénérer de nouveaux tissus correspondraient parfaitement au donneur de l'ADN d'origine. Par exemple, un patient atteint de leucémie n'aurait pas besoin d'un frère ou d'une sœur dont les tissus correspondent pour une greffe de moelle osseuse.
ART CONNECTION
Pourquoi Dolly était-elle un mouton Finn-Dorset et non un mouton Blackface écossais ?
Génie génétique
L'utilisation de la technologie de l'ADN recombinant pour modifier l'ADN d'un organisme afin d'obtenir des caractères souhaitables s'appelle le génie génétique. L'ajout d'ADN étranger sous forme de vecteurs d'ADN recombinant générés par clonage moléculaire est la méthode la plus courante de génie génétique. Un organisme qui reçoit l'ADN recombinant est appelé organisme génétiquement modifié (OGM). Si l'ADN étranger introduit provient d'une espèce différente, l'organisme hôte est dit transgénique. Les bactéries, les plantes et les animaux ont été génétiquement modifiés depuis le début des années 1970 à des fins universitaires, médicales, agricoles et industrielles. Ces applications seront examinées plus en détail dans le prochain module.
CONCEPT EN ACTION
Regardez cette courte vidéo expliquant comment les scientifiques créent un animal transgénique.
Bien que les méthodes classiques d'étude de la fonction des gènes aient commencé par un phénotype donné et aient déterminé la base génétique de ce phénotype, les techniques modernes permettent aux chercheurs de commencer par le niveau de la séquence d'ADN et de se demander : « À quoi sert ce gène ou cet élément d'ADN ? » Cette technique, appelée génétique inverse, a permis d'inverser la méthodologie génétique classique. Un exemple de cette méthode est analogue à l'endommagement d'une partie du corps pour déterminer sa fonction. Un insecte qui perd une aile ne peut pas voler, ce qui signifie que la fonction de l'aile est de voler. La méthode génétique classique compare des insectes incapables de voler à des insectes capables de voler et observe que les insectes non volants ont perdu leurs ailes. De même, dans le cadre d'une approche de génétique inverse, la mutation ou la suppression de gènes fournissent aux chercheurs des indices sur la fonction des gènes. La génétique inverse peut également être utilisée pour provoquer la surexpression d'un gène afin de déterminer quels effets phénotypiques peuvent survenir.
Résumé
Les acides nucléiques peuvent être isolés des cellules à des fins d'analyse plus approfondie en brisant les cellules et en détruisant enzymatiquement toutes les autres macromolécules majeures. Les chromosomes fragmentés ou entiers peuvent être séparés en fonction de leur taille par électrophorèse sur gel. De courtes portions d'ADN peuvent être amplifiées par PCR. L'ADN peut être coupé (puis réépissé) à l'aide d'enzymes de restriction. Les techniques moléculaires et cellulaires de la biotechnologie permettent aux chercheurs de créer des organismes génétiquement modifiés et de les modifier pour obtenir les caractéristiques souhaitées.
Le clonage peut impliquer le clonage de petits fragments d'ADN (clonage moléculaire) ou le clonage d'organismes entiers (clonage reproductif). Lors du clonage moléculaire avec des bactéries, un fragment d'ADN souhaité est inséré dans un plasmide bactérien à l'aide d'enzymes de restriction et le plasmide est absorbé par une bactérie, qui exprimera ensuite l'ADN étranger. À l'aide d'autres techniques, des gènes étrangers peuvent être insérés dans des organismes eucaryotes. Dans chaque cas, les organismes sont appelés organismes transgéniques. Lors du clonage reproductif, le noyau d'un donneur est introduit dans un ovule énucléé, qui est ensuite stimulé pour se diviser et se développer en un organisme.
Dans les méthodes de génétique inverse, un gène est muté ou retiré d'une manière ou d'une autre pour identifier son effet sur le phénotype de l'organisme entier et ainsi déterminer sa fonction.
Connexions artistiques
Figure\(\PageIndex{6}\) : Pourquoi Dolly était-elle une brebis finlandaise du Dorset et non une brebis Blackface écossaise ?
- Réponse
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Parce que même si la cellule d'origine provenait d'un mouton Blackface écossais et que la mère porteuse était une Scottish Blackface, l'ADN provenait d'un Finn-Dorset.
Lexique
- recuit
- en biologie moléculaire, processus par lequel deux brins simples d'ADN se lient à des nucléotides complémentaires pour former une molécule bicaténaire
- biotechnologie
- l'utilisation de méthodes artificielles pour modifier le matériel génétique d'organismes ou de cellules vivants afin de produire de nouveaux composés ou de remplir de nouvelles fonctions
- clonage
- la production d'une copie exacte, en particulier d'une copie génétique exacte, d'un gène, d'une cellule ou d'un organisme
- électrophorèse sur gel
- une technique utilisée pour séparer les molécules en fonction de leur capacité à migrer à travers un gel semi-solide en réponse à un courant électrique
- génie génétique
- modification de la constitution génétique d'un organisme à l'aide des méthodes moléculaires de la biotechnologie
- organisme génétiquement modifié (OGM)
- un organisme dont le génome a été modifié artificiellement
- plasmide
- petite molécule circulaire d'ADN présente dans les bactéries qui se réplique indépendamment du chromosome bactérien principal ; les plasmides codent certains caractères importants pour les bactéries et peuvent être utilisés comme vecteurs pour transporter l'ADN dans les bactéries dans le cadre d'applications de génie génétique
- réaction en chaîne par polymérase (PCR)
- une technique utilisée pour fabriquer de multiples copies de l'ADN
- ADN recombinant
- combinaison de fragments d'ADN générés par clonage moléculaire qui n'existe pas dans la nature
- protéine recombinante
- une protéine exprimée à partir de molécules d'ADN recombinant
- enzyme de restriction
- une enzyme qui reconnaît une séquence nucléotidique spécifique dans l'ADN et coupe l'ADN en double brin au niveau de ce site de reconnaissance, souvent avec une coupure en quinconce, laissant des brins simples courts ou des extrémités « collantes »
- génétique inversée
- une forme d'analyse génétique qui manipule l'ADN pour perturber ou affecter le produit d'un gène afin d'analyser la fonction du gène
- clonage reproductif
- clonage d'organismes entiers
- transgénique
- décrivant un organisme qui reçoit de l'ADN d'une espèce différente