14.2 : Structure et séquençage de l'ADN

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Compétences à développer

Décrire la structure de l'ADN
Expliquer la méthode Sanger de séquençage de l'ADN
Discuter des similitudes et des différences entre l'ADN eucaryote et l'ADN procaryote

Les éléments constitutifs de l'ADN sont les nucléotides. Les composants importants du nucléotide sont une base azotée, le désoxyribose (sucre à 5 carbones) et un groupe phosphate (Figure\(\PageIndex{1}\)). Le nucléotide est nommé en fonction de la base azotée. La base azotée peut être une purine telle que l'adénine (A) et la guanine (G), ou une pyrimidine telle que la cytosine (C) et la thymine (T).

L'illustration montre la structure d'un nucléoside, qui est constitué d'un pentose auquel est fixée une base azotée en position 1'. Il existe deux types de bases azotées : les pyrimidines, qui ont un cycle à six chaînons, et les purines, qui ont un cycle à six chaînons fusionné à un cycle à cinq chaînons. La cytosine, la thymine et l'uracile sont des pyrimidines, tandis que l'adénine et la guanine sont des purines. Un nucléoside auquel un phosphate est fixé en position 5' est appelé mononucléotide. Un nucléoside auquel deux ou trois phosphates sont attachés est appelé nucléotide diphosphate ou nucléotide triphosphate, respectivement. — Figure\(\PageIndex{1}\) : Chaque nucléotide est composé d'un sucre, d'un groupe phosphate et d'une base azotée. Le sucre est du désoxyribose dans l'ADN et du ribose dans l'ARN.

Les nucléotides se combinent entre eux par des liaisons covalentes appelées liaisons ou liaisons phosphodiester. Les purines ont une structure à double cycle avec un cycle à six chaînons fusionné à un cycle à cinq chaînons. Les pyrimidines sont de plus petite taille ; elles ont une structure cyclique unique à six chaînons. Les atomes de carbone du sucre à cinq carbones sont numérotés 1', 2', 3', 4' et 5' (1' est lu comme « un nombre premier »). Le résidu de phosphate est attaché au groupe hydroxyle du carbone 5' d'un sucre d'un nucléotide et au groupe hydroxyle du carbone 3' du sucre du nucléotide suivant, formant ainsi une liaison phosphodiester 5'-3'.

Dans les années 1950, Francis Crick et James Watson ont travaillé ensemble pour déterminer la structure de l'ADN à l'université de Cambridge, en Angleterre. D'autres scientifiques comme Linus Pauling et Maurice Wilkins exploraient également activement ce domaine. Pauling avait découvert la structure secondaire des protéines par cristallographie aux rayons X. Dans le laboratoire de Wilkins, la chercheuse Rosalind Franklin utilisait des méthodes de diffraction aux rayons X pour comprendre la structure de l'ADN. Watson et Crick ont pu reconstituer le puzzle de la molécule d'ADN sur la base des données de Franklin, car Crick avait également étudié la diffraction des rayons X (Figure\(\PageIndex{2}\)). En 1962, James Watson, Francis Crick et Maurice Wilkins ont reçu le prix Nobel de médecine. Malheureusement, Franklin était décédé à ce moment-là et les prix Nobel ne sont pas décernés à titre posthume.

La photo de la partie A montre James Watson, Francis Crick et Maclyn McCarty. Le diagramme de diffraction des rayons X de la partie b est symétrique, avec des points en forme de X — Figure\(\PageIndex{2}\) : Les travaux de scientifiques pionniers (a) James Watson, Francis Crick et Maclyn McCarty ont permis de mieux comprendre l'ADN aujourd'hui. La scientifique Rosalind Franklin a découvert (b) le diagramme de diffraction des rayons X de l'ADN, qui a permis d'élucider sa structure en double hélice. (crédit a : modification d'une œuvre de Marjorie McCarty, Public Library of Science)

Watson et Crick ont proposé que l'ADN soit composé de deux brins tordus l'un autour de l'autre pour former une hélice droitière. L'appariement de bases a lieu entre une purine et une pyrimidine ; à savoir, les paires A avec les paires T et G avec C. L'adénine et la thymine sont des paires de bases complémentaires, et la cytosine et la guanine sont également des paires de bases complémentaires. Les paires de bases sont stabilisées par des liaisons hydrogène ; l'adénine et la thymine forment deux liaisons hydrogène et la cytosine et la guanine forment trois liaisons hydrogène. Les deux brins sont de nature antiparallèle, c'est-à-dire que l'extrémité 3' d'un brin fait face à l'extrémité 5' de l'autre brin. Le sucre et le phosphate des nucléotides forment l'épine dorsale de la structure, tandis que les bases azotées sont empilées à l'intérieur. Chaque paire de bases est séparée de l'autre paire de bases par une distance de 0,34 nm, et chaque tour de l'hélice mesure 3,4 nm. Par conséquent, dix paires de bases sont présentes par tour de l'hélice. Le diamètre de la double hélice d'ADN est de 2 nm et il est uniforme partout. Seul l'appariement entre une purine et une pyrimidine peut expliquer le diamètre uniforme. La torsion des deux torons l'un autour de l'autre entraîne la formation de rainures principales et mineures uniformément espacées (Figure\(\PageIndex{3}\)).

La partie A montre l'illustration d'une double hélice d'ADN, qui possède un squelette sucre-phosphate à l'extérieur et des paires de bases azotées à l'intérieur. La partie B montre l'appariement des bases entre la thymine et l'adénine, qui forment deux liaisons hydrogène, et entre la guanine et la cytosine, qui forment trois liaisons hydrogène. La partie C montre un modèle moléculaire de la double hélice de l'ADN. L'extérieur de l'hélice alterne entre des espaces larges, appelés rainures principales, et des espaces étroits, appelés rainures mineures. — Figure\(\PageIndex{3}\) : L'ADN possède (a) une structure en double hélice et (b) des liaisons phosphodiester. Les sillons (c) majeurs et mineurs sont des sites de liaison pour les protéines liant l'ADN lors de processus tels que la transcription (copie de l'ARN à partir de l'ADN) et la réplication.

Techniques de séquençage ADN

Jusqu'aux années 1990, le séquençage de l'ADN (lecture de la séquence de l'ADN) était un processus relativement long et coûteux. L'utilisation de nucléotides radiomarqués a également aggravé le problème en raison de problèmes de sécurité. Avec la technologie actuellement disponible et les machines automatisées, le processus est peu coûteux, plus sûr et peut être achevé en quelques heures. Fred Sanger a développé la méthode de séquençage utilisée pour le projet de séquençage du génome humain, largement utilisée aujourd'hui (Figure\(\PageIndex{4}\)).

Lien vers l'apprentissage

Visitez ce site pour visionner une vidéo expliquant la technique de lecture de séquences d'ADN issue des travaux de Sanger.

La méthode est connue sous le nom de méthode de terminaison de la chaîne didésoxy. La méthode de séquençage est basée sur l'utilisation de terminateurs de chaîne, les didésoxynucléotides (DDNTP). Les didésoxynucléotides, ou DDNTPSS, diffèrent des désoxynucléotides par l'absence de groupe 3' OH libre sur le sucre à cinq carbones. Si un ddNTP est ajouté à un brin d'ADN en croissance, la chaîne ne s'étend pas davantage car le groupe 3' OH libre nécessaire à l'ajout d'un autre nucléotide n'est pas disponible. En utilisant un rapport prédéterminé de désoxyribonucléotides et de didésoxynucléotides, il est possible de générer des fragments d'ADN de différentes tailles.

La partie A montre un brin d'ADN modèle et des brins nouvellement synthétisés qui ont été générés en présence de didésoxynucléotides qui terminent la chaîne en différents points pour générer des fragments de différentes tailles. Chaque didésoxynucléotide est marqué d'une couleur différente. La partie B montre une lecture de séquence qui a été générée après la séparation des fragments d'ADN sur la base de leur taille. La couleur du fragment indique l'identité du nucléotide à l'extrémité d'un fragment donné. En lisant les couleurs dans l'ordre, la séquence d'ADN peut être déterminée. — Figure\(\PageIndex{4}\) : Dans la méthode de terminaison de la chaîne didésoxy de Frederick Sanger, des didésoxynucléotides marqués par un colorant sont utilisés pour générer des fragments d'ADN qui se terminent à différents points. L'ADN est séparé par électrophorèse capillaire en fonction de sa taille, et la séquence d'ADN peut être lue à partir de l'ordre des fragments formés. La lecture de la séquence d'ADN est affichée sur un électrophérogramme généré par un scanner laser.

L'échantillon d'ADN à séquencer est dénaturé ou séparé en deux brins en le chauffant à des températures élevées. L'ADN est divisé en quatre tubes dans lesquels sont ajoutés une amorce, l'ADN polymérase, et les quatre nucléotides (A, T, G et C). En plus de chacun des quatre tubes, des quantités limitées de l'un des quatre didésoxynucléotides sont ajoutées à chaque tube respectivement. Les tubes sont marqués comme A, T, G et C en fonction du DDnTP ajouté. À des fins de détection, chacun des quatre didésoxynucléotides porte un marqueur fluorescent différent. L'allongement de la chaîne se poursuit jusqu'à ce qu'un nucléotide didésoxy fluorescent soit incorporé, après quoi aucun autre allongement n'a lieu. Une fois la réaction terminée, une électrophorèse est réalisée. Même une différence de longueur d'une seule base peut être détectée. La séquence est lue à partir d'un scanner laser. Pour ses travaux sur le séquençage de l'ADN, Sanger a reçu un prix Nobel de chimie en 1980.

Lien vers l'apprentissage

Le séquençage du génome de Sanger a donné lieu à une course au séquençage rapide et peu coûteux des génomes humains, ce que l'on appelle souvent la séquence de 1 000 dollars en un jour. Pour en savoir plus, sélectionnez l'animation Sequencing at Speed ici.

L'électrophorèse sur gel est une technique utilisée pour séparer des fragments d'ADN de différentes tailles. Habituellement, le gel est composé d'un produit chimique appelé agarose. La poudre d'agarose est ajoutée à un tampon et chauffée. Après refroidissement, la solution de gel est versée dans un plateau de coulée. Une fois le gel solidifié, l'ADN est chargé sur le gel et un courant électrique est appliqué. L'ADN possède une charge négative nette et se déplace de l'électrode négative vers l'électrode positive. Le courant électrique est appliqué pendant suffisamment de temps pour permettre à l'ADN de se séparer en fonction de sa taille ; les plus petits fragments seront les plus éloignés du puits (où l'ADN a été chargé), et les fragments de poids moléculaire plus lourd seront les plus proches du puits. Une fois l'ADN séparé, le gel est coloré avec un colorant spécifique à l'ADN pour le visualiser (Figure\(\PageIndex{5}\)).

La photo montre un gel d'agarose éclairé par des rayons UV. Le gel fait neuf voies de travers. Chaque voie était remplie d'un échantillon contenant des fragments d'ADN de tailles différentes qui se sont séparés en traversant le gel, de haut en bas. L'ADN apparaît sous forme de fines bandes blanches sur fond noir. Les voies 1 et 9 contiennent de nombreuses bandes issues d'un standard ADN. Ces bandes sont étroitement espacées vers le haut et espacées plus loin vers le bas du gel. Les voies 2 à 8 contiennent chacune une ou deux bandes. Certaines de ces bandes sont de taille identique et parcourent la même distance dans le gel. D'autres parcourent une distance légèrement différente, ce qui indique une petite différence de taille. — Figure\(\PageIndex{5}\) : L'ADN peut être séparé en fonction de sa taille par électrophorèse sur gel. (crédit : James Jacob, Tompkins Cortland Community College)

Evolution Connection : le génome de Néandertal - Comment sommes-nous liés ?

La première ébauche de séquence du génome de Néandertal a été récemment publiée par Richard E. Green et al. en 2010. ¹ Les Néandertaliens sont les ancêtres les plus proches des humains actuels. Ils étaient connus pour avoir vécu en Europe et en Asie occidentale avant de disparaître des archives fossiles il y a environ 30 000 ans. L'équipe de Green a étudié des vestiges fossiles vieux de près de 40 000 ans sélectionnés dans des sites du monde entier. Des moyens extrêmement sophistiqués de préparation des échantillons et de séquençage de l'ADN ont été utilisés en raison de la fragilité des os et de la forte contamination microbienne. Dans leur étude, les scientifiques ont pu séquencer environ quatre milliards de paires de bases. La séquence de Néandertal a été comparée à celle des humains actuels du monde entier. Après avoir comparé les séquences, les chercheurs ont découvert que le génome de Néandertal présentait 2 à 3 pour cent plus de similitude avec les personnes vivant hors d'Afrique qu'avec les personnes vivant en Afrique. Alors que les théories actuelles suggèrent que tous les humains actuels peuvent être attribués à une petite population ancestrale en Afrique, les données du génome de Néandertal peuvent contredire ce point de vue. Green et ses collègues ont également découvert des segments d'ADN chez des personnes en Europe et en Asie qui ressemblent davantage à des séquences de Néandertal qu'à d'autres séquences humaines contemporaines. Une autre observation intéressante est que les Néandertaliens sont aussi étroitement liés aux habitants de Papouasie-Nouvelle-Guinée qu'à ceux de Chine ou de France. Cela est surprenant car les restes fossiles de Néandertal n'ont été localisés qu'en Europe et en Asie occidentale. Très probablement, des échanges génétiques ont eu lieu entre les Néandertaliens et les humains modernes lorsque les humains modernes sont sortis d'Afrique, avant la divergence des Européens, des Asiatiques de l'Est et des Papouasie-Nouvelle-Guinée.

Plusieurs gènes semblent avoir subi des modifications chez les Néandertaliens au cours de l'évolution des humains actuels. Ces gènes sont impliqués dans la structure crânienne, le métabolisme, la morphologie de la peau et le développement cognitif. L'un des gènes particulièrement intéressants est RUNX2, qui est différent chez les humains modernes et les Néandertaliens. Ce gène est responsable de l'os frontal proéminent, de la cage thoracique en forme de cloche et des différences dentaires observées chez les Néandertaliens. On suppose qu'un changement évolutif de RUNX2 a joué un rôle important dans l'origine des humains modernes, et qu'il a affecté le crâne et le haut du corps.

Lien vers l'apprentissage

Regardez la conférence de Svante Pääbo expliquant la recherche sur le génome de Néandertal lors de la conférence annuelle TED (Technology, Entertainment, Design) 2011.

Emballage de l'ADN dans les cellules

Lorsque l'on compare des cellules procaryotes à des cellules eucaryotes, les procaryotes sont beaucoup plus simples que les eucaryotes dans bon nombre de leurs caractéristiques (Figure\(\PageIndex{6}\)). La plupart des procaryotes contiennent un seul chromosome circulaire qui se trouve dans une zone du cytoplasme appelée nucléoïde.

L'illustration montre une cellule eucaryote, qui possède un noyau lié à la membrane contenant de la chromatine et un nucléole, et une cellule procaryote, dont l'ADN est contenu dans une zone du cytoplasme appelée nucléoïde. La cellule procaryote est beaucoup plus petite que la cellule eucaryote. — Figure\(\PageIndex{6}\) : Un eucaryote contient un noyau bien défini, alors que chez les procaryotes, le chromosome se trouve dans le cytoplasme, dans une zone appelée nucléoïde.

Exercice\(\PageIndex{1}\)

Dans les cellules eucaryotes, la synthèse de l'ADN et de l'ARN se produit dans un compartiment distinct de la synthèse des protéines. Dans les cellules procaryotes, les deux processus se produisent ensemble. Quels avantages pourrait présenter la séparation des processus ? Quels avantages y aurait-il à les voir se produire ensemble ?

Réponse: La compartimentation permet à une cellule eucaryote de diviser les processus en étapes distinctes afin de créer des produits protéiques et ARN plus complexes. Mais le fait d'avoir un seul compartiment présente également un avantage : la synthèse de l'ARN et des protéines se fait beaucoup plus rapidement dans une cellule procaryote.

La taille du génome de l'un des procaryotes les plus étudiés, E. coli, est de 4,6 millions de paires de bases (environ 1,1 mm, si elles sont coupées et étirées). Alors, comment cela s'insère-t-il dans une petite cellule bactérienne ? L'ADN est déformé par ce que l'on appelle le superenroulement. Le superenroulement signifie que l'ADN est soit sous-enroulé (moins d'un tour d'hélice pour 10 paires de bases) soit surenroulé (plus d'un tour pour 10 paires de bases) par rapport à son état normal de relaxation. Certaines protéines sont connues pour être impliquées dans le superenroulement ; d'autres protéines et enzymes, telles que l'ADN gyrase, aident à maintenir la structure superenroulée.

Les eucaryotes, dont les chromosomes sont constitués chacun d'une molécule d'ADN linéaire, utilisent un type de stratégie d'emballage différent pour insérer leur ADN à l'intérieur du noyau (Figure\(\PageIndex{7}\)). Au niveau le plus élémentaire, l'ADN est enroulé autour de protéines appelées histones pour former des structures appelées nucléosomes. Les histones sont des protéines conservées au cours de l'évolution qui sont riches en acides aminés basiques et forment un octamère. L'ADN (qui est chargé négativement à cause des groupes phosphates) est étroitement enroulé autour du noyau de l'histone. Ce nucléosome est lié au suivant à l'aide d'un ADN de liaison. Cette structure est également connue sous le nom de « perles sur une chaîne ». Ceci est ensuite compacté pour former une fibre de 30 nm, soit le diamètre de la structure. Au stade de la métaphase, les chromosomes sont les plus compacts, mesurent environ 700 nm de largeur et sont associés à des protéines d'échafaudage.

En interphase, les chromosomes eucaryotes possèdent deux régions distinctes qui peuvent être distinguées par coloration. La région étroitement emballée est connue sous le nom d'hétérochromatine et la région la moins dense est appelée euchromatine. L'hétérochromatine contient généralement des gènes qui ne sont pas exprimés et se trouve dans les régions du centromère et des télomères. L'euchromatine contient généralement des gènes qui sont transcrits, l'ADN étant encapsulé autour des nucléosomes mais pas davantage compacté.

L'illustration montre les niveaux d'organisation des chromosomes eucaryotes, en commençant par la double hélice de l'ADN, qui entoure les protéines histones. La molécule d'ADN entière s'enroule autour de nombreux groupes de protéines histones, formant une structure qui ressemble à des perles sur une chaîne. La chromatine est ensuite condensée en s'enroulant autour d'un noyau protéique. Le résultat est un chromosome compact, présenté sous forme dupliquée. — Figure\(\PageIndex{7}\) : Ces figures illustrent le compactage du chromosome eucaryote.

Résumé

Le modèle actuellement accepté de la structure en double hélice de l'ADN a été proposé par Watson et Crick. Parmi les principales caractéristiques, citons le fait que les deux brins qui constituent la double hélice sont de nature complémentaire et antiparallèle. Les sucres désoxyribose et les phosphates forment l'épine dorsale de la structure et les bases azotées sont empilées à l'intérieur. Le diamètre de la double hélice, 2 nm, est uniforme dans l'ensemble. Une purine se couple toujours avec une pyrimidine ; A se couple avec T et G se couple avec C. Un tour de l'hélice comporte dix paires de bases. Au cours de la division cellulaire, chaque cellule fille reçoit une copie de l'ADN par un processus connu sous le nom de réplication de l'ADN. Les procaryotes sont beaucoup plus simples que les eucaryotes dans bon nombre de leurs caractéristiques. La plupart des procaryotes contiennent un seul chromosome circulaire. En général, les chromosomes eucaryotes contiennent une molécule d'ADN linéaire encapsulée dans des nucléosomes et possèdent deux régions distinctes qui peuvent être distinguées par coloration, reflétant différents états d'encapsulation et de compactage.

Notes

1 Richard E. Green et al., « Une ébauche de séquence du génome de Néandertal », Science 328 (2010) : 710-22.

Lexique

électrophorèse: technique utilisée pour séparer les fragments d'ADN en fonction de leur taille