10.1: 克隆和基因工程
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生物技术是使用人工方法来改变活生物体或细胞的遗传物质，以产生新的化合物或发挥新的功能。 自农业开始以来，生物技术就被用于通过选择性育种来改良牲畜和作物。 自从1953年发现DNA结构以来，特别是自1970年代开发出操纵DNA的工具和方法以来，生物技术已成为在分子层面上操纵生物体DNA的代名词。 该技术的主要应用是医学（用于生产疫苗和抗生素）和农业（用于作物的基因改造）。 生物技术还有许多工业应用，例如发酵、漏油处理、生物燃料的生产，以及许多家庭应用，例如在衣物洗涤剂中使用酶。
操纵遗传物质
要完成上述应用，生物技术人员必须能够提取、操作和分析核酸。
核酸结构综述
要了解用于处理核酸的基本技术，请记住核酸是由核苷酸（糖、磷酸盐和含氮碱）组成的大分子。 这些分子上的磷酸基团各有净负电荷。 真核生物核中的一整组 DNA 分子被称为基因组。 DNA有两条互补链，通过配对碱基之间的氢键相连。
与真核细胞中的 DNA 不同，RNA 分子会离开细胞核。 Messenger RNA（mRNA）的分析频率最高，因为它代表细胞中表达的蛋白质编码基因。
核酸的分离
要研究或操纵核酸，必须首先从细胞中提取 DNA。 使用各种技术提取不同类型的DNA（图\(\PageIndex{1}\)）。 大多数核酸提取技术都涉及分解细胞的步骤，然后使用酶促反应摧毁所有不需要的大分子。 使用含有缓冲化合物的洗涤剂溶液将细胞分解。 为了防止降解和污染，使用酶灭活蛋白质和RNA等大分子。 然后使用酒精将DNA从溶液中抽出。 由此产生的DNA由于由长聚合物组成，因此形成凝胶状物质。
研究RNA以了解细胞中的基因表达模式。 RNA自然非常不稳定，因为分解RNA的酶通常存在于自然界中。 有些甚至是由我们自己的皮肤分泌的，很难失活。 与DNA提取类似，RNA提取涉及使用各种缓冲液和酶来使其他大分子失活并仅保留RNA。
凝胶电泳
由于核酸是水环境中在中性或碱性 pH 值下带负电荷的离子，因此它们可以通过电场移动。 凝胶电泳是一种用于根据大小和电荷分离带电分子的技术。 核酸可以作为整条染色体或片段分离。 核酸被加载到凝胶基质一端的槽中，施加电流，然后将带负电荷的分子拉向凝胶的另一端（带有正电极的一端）。 较小的分子在凝胶孔隙中的移动速度比较大的分子快；这种迁移速率的差异会根据大小将碎片分开。 凝胶基质中的核酸在被可见的化合物（例如染料）染色之前是不可见的。 不同的核酸片段在距离凝胶顶部（负极端）特定距离处以条带形式出现，具体取决于它们的大小（图\(\PageIndex{2}\)）。 许多不同大小的片段的混合物表现为长涂片，而未切割的基因组DNA通常太大，无法穿过凝胶，在凝胶顶部形成一条大带。
聚合酶链反应
DNA分析通常需要关注基因组的一个或多个特定区域。 它还经常涉及只有一个或几个DNA分子拷贝可供进一步分析的情况。 对于大多数手术，例如凝胶电泳，这些量是不够的。 聚合酶链反应（PCR）是一种用于快速增加 DNA 特定区域拷贝数量以供进一步分析的技术（图\(\PageIndex{3}\)）。 聚合酶链反应使用一种特殊形式的 DNA 聚合酶，即复制 DNA 的酶，以及其他称为引物的短核苷酸序列，这些序列与正在复制的 DNA 的特定部分碱基配对。 聚合酶链反应在实验室中有多种用途。 其中包括：1）鉴定留在犯罪现场的DNA样本的所有者；2）亲子鉴定；3）将少量古代DNA与现代生物进行比较；4）确定特定区域的核苷酸序列。
克隆
一般而言，克隆意味着创建完美的复制品。 通常，该词用于描述遗传上相同的副本的创建。 在生物学中，整个生物体的再现被称为 “生殖性克隆”。 早在尝试克隆整个生物体之前，研究人员就学会了如何复制短片段的DNA，这个过程被称为分子克隆。
分子克隆
克隆允许创建多个基因拷贝、表达基因和研究特定基因。 为了将 DNA 片段以将被复制或表达的形式带入细菌细胞，首先将该片段插入质粒中。 质粒（在本文中也称为载体）是一种环状 DNA 的小分子，可独立于细菌中的染色体 DNA 复制。 在克隆中，质粒分子可用于提供插入所需DNA片段的 “载体”。 改良的质粒通常被重新引入细菌宿主中进行复制。 随着细菌的分裂，它们会复制自己的DNA（包括质粒）。 插入的 DNA 片段与其余细菌 DNA 一起复制。 在细菌细胞中，来自人类基因组（或其他正在研究的生物）的DNA片段被称为外源DNA，以将其与细菌的DNA（宿主DNA）区分开来。
质粒自然存在于细菌群体（例如大肠杆菌）中，其基因可以为生物体带来有利特征，例如抗生素耐药性（不受抗生素影响的能力）。 质粒已被高度工程化，可作为分子克隆和随后大规模生产胰岛素等重要分子的载体。 质粒载体的一个重要特征是可以轻松引入外来的 DNA 片段。 这些质粒载体包含许多短的 DNA 序列，可以使用不同的常用限制酶来切割这些序列。 限制酶（也称为限制性内切核酸酶）可识别特定的DNA序列并以可预测的方式切割它们；它们是由细菌自然产生的，是抵御外来DNA的防御机制。 许多限制酶在两条 DNA 链上交错切开，因此切口端有 2 到 4 个核苷酸的单链悬垂。 限制酶识别的序列是四到八核苷酸序列，是一种回文。 就像回文一词一样，这意味着序列的向前和向后读取相同。 在大多数情况下，序列在一条链上向前读取相同，在互补链上向后读取相同。 当按这样的顺序进行交错切割时，悬伸是互补的（图\(\PageIndex{4}\)）。
由于这些悬垂物能够通过氢键与使用相同限制酶切割的 DNA 片段上的互补悬垂物重聚在一起，因此它们被称为 “粘性末端”。 在单链上的互补序列之间形成氢键以形成双链 DNA 的过程称为退火。 添加一种叫做 DNA 连接酶的酶，它参与细胞中的 DNA 复制，当粘性末端聚集在一起时，它会永久连接到 DNA 片段。 通过这种方式，任何DNA片段都可以在使用相同限制酶切割的质粒DNA的两端之间拼接（图\(\PageIndex{5}\)）。
插入外来DNA的质粒被称为重组DNA分子，因为它们含有新的遗传物质组合。 由重组 DNA 分子产生的蛋白质称为重组蛋白。 并非所有的重组质粒都能够表达基因。 也可以对质粒进行改造，使其仅在受到某些环境因素刺激时才表达蛋白质，这样科学家就可以控制重组蛋白的表达。
生殖性克隆
生殖性克隆是一种用于制作整个多细胞生物的克隆或相同副本的方法。 大多数多细胞生物是通过性方式繁殖的，这涉及两个个体（父母）的DNA的贡献，因此无法生成亲本任何一方的相同副本或克隆。 生物技术的最新进展使得在实验室中繁殖克隆哺乳动物成为可能。
自然有性生殖涉及受精过程中精子和卵子的结合。 这些配子中的每一个都是单倍体，这意味着它们的核中包含一组染色体。 然后，由此产生的细胞或合子是二倍体，包含两组染色体。 该细胞通过有丝分裂分裂产生多细胞生物。 但是，任何两个细胞的结合都无法产生活的合子；卵细胞的细胞质中有些成分对于胚胎在最初的几个细胞分裂期间的早期发育至关重要。 没有这些规定，以后就不会有发展。 因此，要产生一个新的个体，既需要二倍体遗传补体，也需要卵细胞质。 产生人工克隆个体的方法是取出一个个体的卵细胞，然后去除单倍体核。 然后，来自第二个个体，即捐赠者的身体细胞的二倍体核被放入卵细胞中。 然后刺激卵子分裂，从而继续发育。 这听起来很简单，但实际上需要多次尝试才能成功完成每个步骤。
第一个克隆的农用动物是多莉，这是一只出生于1996年的绵羊。 当时生殖性克隆的成功率很低。 多莉活了六年，死于肺瘤（图\(\PageIndex{6}\)）。 有人猜测，由于产生多莉的细胞 DNA 来自年龄较大的个体，因此 DNA 的年龄可能影响了她的预期寿命。 自多莉以来，已经成功克隆了几种动物（例如马、公牛和山羊）。
有人试图生产克隆的人类胚胎作为胚胎干细胞的来源。 在此过程中，来自成年人类的DNA被引入人类卵细胞，然后刺激卵细胞分裂。 该技术与用于生产多莉的技术相似，但胚胎从未植入代孕妈妈身上。 产生的细胞被称为胚胎干细胞，因为它们有能力发育成许多不同种类的细胞，例如肌肉或神经细胞。 干细胞可用于研究并最终提供治疗应用，例如替代受损组织。 在这种情况下，克隆的好处是，用于再生新组织的细胞将与原始 DNA 的供体完美匹配。 例如，白血病患者不需要具有匹配组织的兄弟姐妹进行骨髓移植。
艺术连接
为什么 Dolly 是 Finn-Dorset 而不是苏格兰黑脸绵羊？
基因工程
使用重组 DNA 技术修改生物体的 DNA 以获得理想的特征被称为基因工程。 以分子克隆产生的重组 DNA 载体的形式添加外来 DNA 是最常见的基因工程方法。 接收重组 DNA 的生物被称为转基因生物（GMO）。 如果引入的外来DNA来自不同的物种，则宿主生物被称为转基因。 自20世纪70年代初以来，细菌、植物和动物已经过基因改造，用于学术、医学、农业和工业目的。 下一个模块将更详细地研究这些应用程序。
尽管研究基因功能的经典方法始于给定的表型并确定了该表型的遗传基础，但现代技术允许研究人员从DNA序列层面开始问：“这个基因或DNA元素有什么作用？” 这种被称为逆向遗传学的技术导致了传统遗传方法的逆转。 这种方法的一个例子类似于损坏身体部位以确定其功能。 失去翅膀的昆虫无法飞行，这意味着翅膀的功能是飞行。 经典的遗传方法将无法飞行的昆虫与能飞的昆虫进行比较，并观察到非飞行昆虫已经失去了翅膀。 同样，在逆向遗传学方法中，突变或删除基因为研究人员提供了有关基因功能的线索。 或者，逆向遗传学可用于使基因过度表达，以确定可能发生哪些表型效应。
摘要
核酸可以从细胞中分离出来，通过分解细胞和酶破坏所有其他主要大分子，进行进一步分析。 通过凝胶电泳，可以根据大小分离片段或整条染色体。 短片段的 DNA 可以通过聚合酶链反应扩增。 可以使用限制酶切DNA（然后重新拼接在一起）。 生物技术的分子和细胞技术使研究人员能够对生物进行基因改造，对其进行改造以获得理想的特征。
克隆可能涉及克隆小的 DNA 片段（分子克隆），或克隆整个生物体（生殖性克隆）。 在使用细菌进行分子克隆时，使用限制酶将所需的 DNA 片段插入细菌质粒中，质粒被细菌吸收，然后细菌将表达外来 DNA。 使用其他技术，可以将外来基因插入真核生物体中。 在每种情况下，这些生物都被称为转基因生物。 在生殖性克隆中，供体核被放入去核的卵细胞中，然后刺激卵细胞分裂并发育成生物体。
在逆向遗传学方法中，以某种方式突变或移除基因，以确定其对整个生物体表型的影响，从而确定其功能。
艺术联系
图\(\PageIndex{6}\)：为什么 Dolly 是 Finn-Dorset 而不是苏格兰黑脸绵羊？
- 回答
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因为尽管原始细胞来自苏格兰黑脸绵羊，代孕母亲是苏格兰黑脸，但DNA来自芬兰多塞特郡。
词汇表
- 退火
- 在分子生物学中，两条单链 DNA 氢在互补核苷酸处结合形成双链分子的过程
- 生物技术
- 使用人工方法修改活生物体或细胞的遗传物质以产生新的化合物或发挥新的功能
- 克隆的
- 生成基因、细胞或生物体的精确副本，特别是精确的遗传副本
- 凝胶电泳
- 一种用于根据分子响应电流通过半固体凝胶迁移的能力来分离分子的技术
- 基因工程
- 使用生物技术的分子方法改变生物体的基因构成
- 转基因生物 (GMO)
- 一种其基因组已被人为改变的生物
- 质粒
- 一种存在于细菌中的小圆形 DNA 分子，可独立于主要细菌染色体复制；质粒编码细菌的一些重要特征，可用作载体，在基因工程应用中将 DNA 输送到细菌中
- 聚合酶链反应 (PCR)
- 一种用于制作多个 DNA 拷贝的技术
- 重组 DNA
- 分子克隆产生的自然界中不存在的 DNA 片段组合
- 重组蛋白
- 一种由重组 DNA 分子表达的蛋白质
- 限制酶
- 一种能识别 DNA 中特定的核苷酸序列并在该识别位点切割 DNA 双链的酶，通常交错切口留下短的单链或 “粘性” 末端
- 逆向遗传学
- 一种遗传分析形式，它操纵 DNA 来破坏或影响基因产物以分析该基因的功能
- 生殖性克隆
- 克隆整个生物
- 转基因
- 描述从不同物种接收 DNA 的生物