9.1: كيف تنمو الميكروبات

Last updated
Save as PDF

Page ID: 195391

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

أهداف التعلم

حدد وقت التوليد للنمو بناءً على الانشطار الثنائي
تحديد ووصف أنشطة الكائنات الحية الدقيقة التي تمر بمراحل نموذجية من الانشطار الثنائي (الانقسام الخلوي البسيط) في منحنى النمو
اشرح العديد من الطرق المعملية المستخدمة لتحديد أعداد الخلايا القابلة للحياة والإجمالية في المجموعات السكانية التي تمر بنمو أسي
وصف أمثلة لانقسام الخلايا التي لا تتضمن الانشطار الثنائي، مثل التبرعم أو التشرذم
وصف تكوين وخصائص الأغشية الحيوية
تحديد المخاطر الصحية المرتبطة بالأفلام الحيوية وكيفية معالجتها
وصف استشعار النصاب ودوره في التواصل من خلية إلى خلية وتنسيق الأنشطة الخلوية

التركيز السريري: الجزء الأول

جيني، امرأة حامل تبلغ من العمر 24 عامًا في الثلث الثاني من الحمل، تزور عيادة تشكو من ارتفاع درجة الحرارة، و 38.9 درجة مئوية (102 درجة فهرنهايت)، والتعب، وآلام العضلات - وهي علامات وأعراض نموذجية تشبه الإنفلونزا. تمارس جيني التمارين الرياضية بانتظام وتتبع نظامًا غذائيًا مغذيًا مع التركيز على الأطعمة العضوية، بما في ذلك الحليب الخام الذي تشتريه من سوق المزارعين المحليين. جميع التحصينات الخاصة بها محدثة. ومع ذلك، فإن مقدم الرعاية الصحية الذي يرى جيني يشعر بالقلق ويطلب إرسال عينة دم للاختبار من قبل مختبر الأحياء الدقيقة.

التمارين\(\PageIndex{1}\)

لماذا يشعر مقدم الرعاية الصحية بالقلق إزاء علامات وأعراض جيني؟

تتضمن دورة الخلايا البكتيرية تكوين خلايا جديدة من خلال تكرار الحمض النووي وتقسيم المكونات الخلوية إلى خليتين صغيرتين. في بدائيات النوى، يكون التكاثر دائمًا غير جنسي، على الرغم من أن إعادة التركيب الجيني واسعة النطاق في شكل نقل أفقي للجينات تحدث، كما سيتم استكشافه في فصل مختلف. تحتوي معظم البكتيريا على كروموسوم دائري واحد؛ ومع ذلك، توجد بعض الاستثناءات. على سبيل المثال، تحتوي بوريليا بورغدورفيري، العامل المسبب لمرض لايم، على كروموسوم خطي.

انشطار ثنائي

الآلية الأكثر شيوعًا لتكاثر الخلايا في البكتيريا هي عملية تسمى الانشطار الثنائي, وهو موضح في الشكل\(\PageIndex{1}\):. قبل الانقسام، تنمو الخلية وتزيد من عدد مكوناتها الخلوية. بعد ذلك، يبدأ تكرار الحمض النووي في موقع على الكروموسوم الدائري يسمى أصل النسخ المتماثل، حيث يتم ربط الكروموسوم بغشاء الخلية الداخلية. يستمر النسخ المتماثل في اتجاهين متعاكسين على طول الكروموسوم حتى الوصول إلى الطرف النهائي.

أ) صورة مجهرية لخليتين على شكل قضيب متصلتين في نهايتيهما. ب) رسم تخطيطي للانشطار الثنائي. تقوم الخلية أولاً بتكرار الحمض النووي الخاص بها واستطالة. ثم، مع استمرار الخلية في الاستطالة، تنتقل كل حلقة من الحمض النووي إلى أحد الطرفين أو الآخر. تبدأ الخلية بعد ذلك في الانقباض في المركز. ينتج عن هذا خليتين تحتوي كل منهما على حلقة من الحمض النووي. — الشكل\(\PageIndex{1}\): (أ) يصور المجهري الإلكتروني خليتين من *السالمونيلا التيفيموريوم* بعد حدث انشطار ثنائي. (ب) يبدأ الانشطار الثنائي في البكتيريا بتكرار الحمض النووي أثناء استطالة الخلية. يتشكل الحاجز الفاصل في وسط الخلية. تتشكل خليتان صغيرتان من نفس الحجم ومنفصلة، وتتلقى كل منهما نسخة من الكروموسوم الأصلي. (المصدر: تعديل العمل من قبل مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها).

يضيق مركز الخلية المتضخمة حتى تتشكل خليتان صغيرتان، يتلقى كل نسل نسخة كاملة من الجينوم الأبوي وتقسيم السيتوبلازم (الحركية السيتوتية). يتم توجيه عملية التحريك الخلوي وتقسيم الخلايا بواسطة بروتين يسمى FtsZ. يتم تجميع FTSZ في حلقة Z على الغشاء السيتوبلازمي (الشكل\(\PageIndex{2}\)). ترتكز الحلقة Z على بروتينات ربط FTSZ وتحدد مستوى الانقسام بين الخليتين البنتين. تتم إضافة البروتينات الإضافية المطلوبة لتقسيم الخلايا إلى الحلقة Z لتشكيل بنية تسمى التقسيم. ينشط الانقسام لإنتاج جدار خلية الببتيدوجليكان وبناء الحاجز الذي يقسم الخليتين البنتين. يتم فصل الخلايا الوليدة عن طريق الحاجز الفاصل، حيث يجب إعادة تشكيل جميع الطبقات الخارجية للخلايا (جدار الخلية والأغشية الخارجية، إن وجدت) لإكمال الانقسام. على سبيل المثال، نعلم أن إنزيمات معينة تكسر الروابط بين المونومرات في الببتيدوجليكان وتسمح بإضافة وحدات فرعية جديدة على طول حاجز التقسيم.

رسم تخطيطي لتقسيم الخلايا. الخلية على شكل الشكل 8؛ كل طرف من الخلية يحتوي على حلقة DNA. تسمى نقطة الانقباض في الشكل 8 ثلم الانقسام. يُطلق على حلقة النقاط في هذه المنطقة اسم ftsZ ring. بعد ذلك تصطف هذه النقاط على طول نقطة الانقباض حيث تفصل نقطة الانقباض تمامًا نصفي الخلية. هذه المنطقة تسمى الآن الحاجز. أخيرًا تنفصل الخليتان تمامًا. — الشكل\(\PageIndex{2}\): تتجمع بروتينات FtsZ لتشكل حلقة Z مثبتة على غشاء البلازما. تقوم الحلقة Z بقرص غلاف الخلية لفصل السيتوبلازم للخلايا الجديدة.

التمارين\(\PageIndex{2}\)

ما اسم البروتين الذي يتجمع في حلقة Z لبدء الحركة الخلوية وانقسام الخلايا؟

وقت الجيل

في الكائنات حقيقية النواة، يكون وقت الجيل هو الوقت بين نفس نقاط دورة الحياة في جيلين متتاليين. على سبيل المثال، وقت الجيل النموذجي للسكان هو 25 عامًا. هذا التعريف غير عملي للبكتيريا، التي قد تتكاثر بسرعة أو تبقى نائمة لآلاف السنين. في بدائيات النواة (البكتيريا والأركيا)، يُطلق على وقت الجيل أيضًا وقت المضاعفة ويُعرّف بأنه الوقت الذي يستغرقه تضاعف عدد السكان خلال جولة واحدة من الانشطار الثنائي. تختلف أوقات مضاعفة البكتيريا بشكل كبير. في حين أن الإشريكية القولونية يمكن أن تتضاعف في أقل من 20 دقيقة في ظل ظروف النمو المثلى في المختبر، قد تحتاج البكتيريا من نفس النوع إلى عدة أيام لتتضاعف في البيئات القاسية بشكل خاص. تنمو معظم مسببات الأمراض بسرعة، مثل E. coli، ولكن هناك استثناءات. على سبيل المثال، تبلغ مدة جيل المتفطرة السلية، العامل المسبب لمرض السل، ما بين 15 و 20 ساعة. من ناحية أخرى، ينمو M. leprae، الذي يسبب مرض هانسن (الجذام)، بشكل أبطأ بكثير، مع مضاعفة الوقت لمدة 14 يومًا.

حساب عدد الخلايا

من الممكن التنبؤ بعدد الخلايا في المجموعة عندما تنقسم على الانشطار الثنائي بمعدل ثابت. على سبيل المثال، ضع في اعتبارك ما يحدث إذا انقسمت خلية واحدة كل 30 دقيقة لمدة 24 ساعة. يوضح الرسم التخطيطي في الشكل\(\PageIndex{3}\) الزيادة في أعداد الخلايا للأجيال الثلاثة الأولى.

يزداد عدد الخلايا بشكل كبير ويمكن التعبير عنه بـ 2 ⁿ، حيث n هو عدد الأجيال. وفي حالة تقسيم الزنزانات كل 30 دقيقة، بعد 24 ساعة، سيكون قد تم إنشاء 48 قسمًا. إذا طبقنا الصيغة 2 ⁿ، حيث n تساوي 48، فإن الخلية الواحدة ستؤدي إلى ظهور 2 ⁴⁸ أو 281،474،976،710،656 خلية في 48 جيلًا (24 ساعة). عند التعامل مع مثل هذه الأرقام الضخمة، يكون استخدام الترميز العلمي أكثر عملية. لذلك، نعبر عن عدد الخلايا كـ 2.8 × 10 ¹⁴ خلية.

في مثالنا، استخدمنا خلية واحدة كرقم أولي للخلايا. بالنسبة لأي عدد من خلايا البداية، يتم تكييف الصيغة على النحو التالي:

\[N_n = N_02^n\]

N _n هو عدد الخلايا في أي جيل n، N ₀ هو العدد الأولي للخلايا، و n هو عدد الأجيال.

في الجيل 0 هناك خلية واحدة. في الجيل الأول هناك خليتان. في الجيل 2 هناك 4 خلايا. في الجيل 3 هناك 8 خلايا. — الشكل\(\PageIndex{3}\): تنقسم الخلية الأبوية وتؤدي إلى ظهور خليتين صغيرتين. تنقسم كل خلية من الخلايا الوليدة بدورها، مما يعطي ما مجموعه أربع خلايا في الجيل الثاني وثماني خلايا في الجيل الثالث. يضاعف كل قسم عدد الخلايا.

التمارين\(\PageIndex{3}\)

باستخدام وقت مضاعفة قدره 30 دقيقة وحجم سكاني أولي يبلغ 1 × ⁵ خلايا، ما عدد الخلايا التي ستتواجد بعد ساعتين، بافتراض عدم موت الخلايا؟

منحنى النمو

تتبع الكائنات الحية الدقيقة التي تزرع في المزرعة المغلقة (المعروفة أيضًا باسم الثقافة المجمعة)، والتي لا تتم فيها إضافة أي مغذيات ولا تتم إزالة معظم النفايات، نمط نمو قابل للتكرار يشار إليه باسم منحنى النمو. مثال على الاستزراع الدفعي في الطبيعة هو البركة التي ينمو فيها عدد صغير من الخلايا في بيئة مغلقة. يتم تعريف كثافة الثقافة على أنها عدد الخلايا لكل وحدة حجم. في البيئة المغلقة، تعد كثافة الثقافة أيضًا مقياسًا لعدد الخلايا في السكان. لا تتبع التهابات الجسم دائمًا منحنى النمو، ولكن يمكن أن توجد الارتباطات اعتمادًا على موقع العدوى ونوعها. عندما يتم رسم عدد الخلايا الحية بمرور الوقت، يمكن ملاحظة المراحل المميزة في المنحنى (الشكل\(\PageIndex{4}\)).

رسم بياني بالوقت على المحور X ولوغاريتم الخلايا البكتيرية الحية على المحور Y. يبدأ خط الرسم البياني باتجاه الجزء السفلي من المحور Y ويكون مسطحًا لفترة قصيرة. هذا يسمى 1) مرحلة التأخر: لا توجد زيادة في عدد الخلايا البكتيرية الحية. بعد ذلك ينحدر الخط لأعلى. تسمى هذه المرحلة اللوغاريتمية: زيادة هائلة في عدد الخلايا البكتيرية الحية. بعد ذلك يتم تسطيح الخط مرة أخرى. هذا يسمى 3) المرحلة الثابتة: الهضبة في عدد الخلايا البكتيرية الحية؛ معدل انقسام الخلايا والموت متساويان تقريبًا. أخيرًا، ينحدر الخط لأسفل. هذا يسمى 4) مرحلة الموت أو الانخفاض: انخفاض هائل في عدد الخلايا البكتيرية الحية. — الشكل\(\PageIndex{4}\): يتم تمثيل منحنى نمو الثقافة البكتيرية من خلال لوغاريتم عدد الخلايا الحية المرسومة كدالة للوقت. يمكن تقسيم الرسم البياني إلى أربع مراحل وفقًا للمنحدر، كل منها يطابق الأحداث في الخلية. المراحل الأربع هي التأخر واللوغ والثابت والموت.

مرحلة التأخر

تمثل بداية منحنى النمو عددًا صغيرًا من الخلايا، التي يشار إليها باسم اللقاح، والتي تتم إضافتها إلى وسط الاستزراع الطازج، وهو مرق غذائي يدعم النمو. تسمى المرحلة الأولية من منحنى النمو بمرحلة التأخر، حيث تستعد الخلايا للمرحلة التالية من النمو. لا يتغير عدد الخلايا خلال مرحلة التأخر؛ ومع ذلك، تنمو الخلايا بشكل أكبر وتنشط في التمثيل الغذائي، وتجمع البروتينات اللازمة للنمو داخل الوسط. في حالة تلف أي خلايا أو صدمتها أثناء النقل إلى الوسيط الجديد، يتم الإصلاح أثناء مرحلة التأخير. يتم تحديد مدة مرحلة التأخر من خلال العديد من العوامل، بما في ذلك الأنواع والتركيب الجيني للخلايا، وتكوين الوسط، وحجم اللقاح الأصلي.

مرحلة السجل

في مرحلة النمو اللوغاريتمي (اللوغاريتمي)، التي تسمى أحيانًا مرحلة النمو الأسي، تنقسم الخلايا بنشاط عن طريق الانشطار الثنائي ويزداد عددها بشكل كبير. بالنسبة لأي نوع بكتيري معين، يتم تحديد وقت التوليد في ظل ظروف نمو محددة (العناصر الغذائية ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة وما إلى ذلك) وراثيًا، ويسمى وقت الجيل هذا بمعدل النمو الجوهري. خلال المرحلة اللوغاريتمية، لا تكون العلاقة بين الوقت وعدد الخلايا خطية بل علاقة أسية؛ ومع ذلك، غالبًا ما يتم رسم منحنى النمو على الرسم البياني شبه اللوغاريتمي، كما هو موضح في الشكل\(\PageIndex{5}\)، الذي يعطي مظهر العلاقة الخطية.

أ) رسم بياني للمقياس الحسابي يوضح نمو المرحلة اللوغاريتمية. المحور X هو الوقت (ساعات) والمحور Y هو خلايا لكل مل. يبدأ الخط الموجود على هذا الرسم البياني بشكل مسطح إلى حد ما بقراءات (1,2) و (5,32) ولكنه ينحدر بسرعة بشكل حاد مع القراءة النهائية لـ (10، 1024). B) هو رسم بياني نصف بياني لنمو المرحلة الطويلة. مرة أخرى، يكون المحور X هو الوقت (الساعات) والمحور Y هو الخلايا لكل مل. لكن الفواصل الزمنية للمحور Y تُظهر بشكل أوضح الفرق بين 10 حرف مرتفع 1 و 10 فوق الحرف 3. الخط في هذا الرسم البياني هو خط مستقيم قطريًا عبر الرسم البياني بنقاط (1,2) و (5,32) و (10,1024) - تمامًا مثل الرسم البياني الأول. المعادلة لكلا الرسمين البيانيين هي N = 2 بخط مرتفع n. — الشكل\(\PageIndex{5}\): يوضح كلا الرسمين البيانيين النمو السكاني خلال المرحلة اللوغاريتمية لعينة بكتيرية ذات تعداد أولي من خلية واحدة ووقت مضاعفة يبلغ ساعة واحدة. (أ) عندما يُرسم على مقياس حسابي، فإن معدل النمو يشبه المنحنى. (ب) عند رسم بياني على مقياس نصف لوغاريتمي (بمعنى أن القيم على المحور y لوغاريتمية)، يظهر معدل النمو خطيًا.

تظهر الخلايا في المرحلة اللوغاريتمية معدل نمو ثابت ونشاط استقلابي موحد. لهذا السبب، يتم استخدام الخلايا في المرحلة اللوغاريتمية بشكل تفضيلي للتطبيقات الصناعية والأعمال البحثية. تعد المرحلة اللوغاريتمية أيضًا المرحلة التي تكون فيها البكتيريا هي الأكثر عرضة لعمل المطهرات والمضادات الحيوية الشائعة التي تؤثر على البروتين والحمض النووي وتكوين جدار الخلية.

المرحلة الثابتة

مع زيادة عدد الخلايا خلال المرحلة اللوغاريتمية، تساهم عدة عوامل في إبطاء معدل النمو. تتراكم منتجات النفايات ويتم استخدام العناصر الغذائية تدريجيًا. بالإضافة إلى ذلك، يبدأ النضوب التدريجي للأكسجين في الحد من نمو الخلايا الهوائية. يؤدي هذا المزيج من الظروف غير المواتية إلى إبطاء النمو السكاني وفي النهاية إيقافه. يصل العدد الإجمالي للخلايا الحية إلى هضبة يشار إليها بالمرحلة الثابتة (الشكل\(\PageIndex{4}\)). في هذه المرحلة، أصبح عدد الخلايا الجديدة الناتجة عن انقسام الخلايا الآن معادلاً لعدد الخلايا الميتة؛ وبالتالي، فإن إجمالي عدد الخلايا الحية راكدة نسبيًا. كثافة الثقافة في الثقافة الثابتة ثابتة. تعتمد القدرة الاستيعابية للثقافة، أو الكثافة القصوى للثقافة، على أنواع الكائنات الحية الدقيقة في الثقافة والظروف المحددة للثقافة؛ ومع ذلك، فإن القدرة الاستيعابية ثابتة لكائن معين ينمو في نفس الظروف.

خلال المرحلة الثابتة، تتحول الخلايا إلى وضع البقاء على قيد الحياة في عملية التمثيل الغذائي. مع تباطؤ النمو، يتباطأ أيضًا تخليق الببتيدوجليكان والبروتينات والأحماض النووية؛ وبالتالي، تكون الثقافات الثابتة أقل عرضة للمضادات الحيوية التي تعطل هذه العمليات. في البكتيريا القادرة على إنتاج المسام الداخلية، تخضع العديد من الخلايا للتبويض خلال المرحلة الثابتة. يتم تصنيع المستقلبات الثانوية، بما في ذلك المضادات الحيوية، في المرحلة الثابتة. في بعض البكتيريا المسببة للأمراض، ترتبط المرحلة الثابتة أيضًا بالتعبير عن عوامل الفوعة، وهي المنتجات التي تساهم في قدرة الميكروب على البقاء والتكاثر والتسبب في المرض في الكائن الحي المضيف. على سبيل المثال، يؤدي استشعار النصاب في Staphylococcus aureus إلى بدء إنتاج الإنزيمات التي يمكنها تكسير الأنسجة البشرية والحطام الخلوي، مما يمهد الطريق للبكتيريا للانتشار إلى الأنسجة الجديدة حيث تكون العناصر الغذائية أكثر وفرة.

مرحلة الموت

عندما تتراكم النفايات السامة في وسط الاستزراع ويتم استنفاد العناصر الغذائية، تموت الخلايا بأعداد أكبر وأكثر. قريباً، يتجاوز عدد الخلايا الميتة عدد الخلايا المنقسمة، مما يؤدي إلى انخفاض هائل في عدد الخلايا (الشكل\(\PageIndex{4}\)). هذه هي مرحلة الموت المسماة بشكل مناسب، والتي تسمى أحيانًا مرحلة التراجع. تتحلل العديد من الخلايا وتطلق العناصر الغذائية في الوسط، مما يسمح للخلايا الباقية بالحفاظ على الحيوية وتشكيل المسام الداخلية. تتميز بعض الخلايا، التي تسمى الخلايا الثابتة، بمعدل استقلابي بطيء. تعد الخلايا المثقوبة مهمة من الناحية الطبية لأنها مرتبطة ببعض أنواع العدوى المزمنة، مثل السل، التي لا تستجيب للعلاج بالمضادات الحيوية.

استدامة النمو الميكروبي

\(\PageIndex{4}\)يحدث نمط النمو الموضح في الشكل في بيئة مغلقة؛ ولا تتم إضافة العناصر الغذائية ولا تتم إزالة النفايات والخلايا الميتة. ومع ذلك، في كثير من الحالات، من المفيد الحفاظ على الخلايا في المرحلة اللوغاريتمية للنمو. أحد الأمثلة على ذلك هو الصناعات التي تحصد المنتجات الميكروبية. يستخدم الكيموستات (الشكل\(\PageIndex{6}\)) للحفاظ على ثقافة مستمرة يتم فيها توفير العناصر الغذائية بمعدل ثابت. يتم خلط كمية مضبوطة من الهواء للعمليات الهوائية. تتم إزالة المعلق البكتيري بنفس معدل تدفق العناصر الغذائية للحفاظ على بيئة نمو مثالية.

رسم للكيميوستات - وعاء مملوء بسائل يتم تحريكه بواسطة شفرة دوارة في المنتصف. تدخل الأعلاف جانبًا وتتدفق الأوراق من الجانب الآخر. — الشكل\(\PageIndex{6}\): الكيموستات عبارة عن وعاء استزراع مزود بفتحة لإضافة العناصر الغذائية (الأعلاف) ومخرج لإزالة المحتويات (النفايات السائلة)، مما يخفف بشكل فعال النفايات السامة والخلايا الميتة. يتم تعديل إضافة السوائل وإزالتها للحفاظ على الثقافة في المرحلة اللوغاريتمية للنمو. في حالة نمو البكتيريا الهوائية، يتم الحفاظ على مستويات الأكسجين المناسبة.

التمارين\(\PageIndex{4}\)

في أي مرحلة يحدث النمو بأسرع معدل؟
اذكر عاملين يحدان من نمو الميكروبات.

قياس نمو البكتيريا

يعد تقدير عدد الخلايا البكتيرية في العينة، والمعروفة باسم تعداد البكتيريا، مهمة شائعة يقوم بها علماء الأحياء الدقيقة. يُعد عدد البكتيريا في العينة السريرية مؤشرًا على مدى الإصابة. تعتمد مراقبة جودة مياه الشرب والغذاء والأدوية وحتى مستحضرات التجميل على تقديرات أعداد البكتيريا للكشف عن التلوث ومنع انتشار المرض. يتم استخدام طريقتين رئيسيتين لقياس رقم الخلية. تتضمن الطرق المباشرة عد الخلايا، بينما تعتمد الطرق غير المباشرة على قياس وجود الخلية أو نشاطها دون حساب الخلايا الفردية فعليًا. لكل من الطرق المباشرة وغير المباشرة مزايا وعيوب لتطبيقات محددة.

عدد الخلايا المباشر

يشير تعداد الخلايا المباشر إلى حساب الخلايا في ثقافة سائلة أو مستعمرات على لوحة. إنها طريقة مباشرة لتقدير عدد الكائنات الحية الموجودة في العينة. دعونا ننظر أولاً إلى طريقة بسيطة وسريعة لا تتطلب سوى شريحة متخصصة ومجهر مركب.

إن أبسط طريقة لحساب البكتيريا تسمى تعداد الخلايا المجهري المباشر، والذي يتضمن نقل حجم معروف من الثقافة إلى شريحة معايرة وحساب الخلايا تحت المجهر الضوئي. تُسمى الشريحة المُعايرة بغرفة بيتروف-هاوسر (الشكل\(\PageIndex{7}\)) وتشبه مقياس كثافة الدم المستخدم لحساب خلايا الدم الحمراء. تم حفر المنطقة المركزية لغرفة العد في مربعات بأحجام مختلفة. تتم إضافة عينة من نظام تعليق الاستزراع إلى الغرفة تحت غطاء يتم وضعه على ارتفاع معين من سطح الشبكة. من الممكن تقدير تركيز الخلايا في العينة الأصلية عن طريق حساب الخلايا الفردية في عدد من المربعات وتحديد حجم العينة التي تمت ملاحظتها. يتم تحديد مساحة المربعات والارتفاع الذي يتم وضع الغطاء عنده للغرفة. يجب تصحيح التركيز للتخفيف إذا تم تخفيف العينة قبل التعداد.

أ) صورة لليد ذات قفاز ممسكة بشريحة سميكة جدًا عليها نقش في منتصف الشريحة. ب) رسم تخطيطي لما تبدو عليه هذه النقوش. تُنشئ النقوش شبكة تحتوي على مربعات أكبر على طول الجزء الخارجي (0.25 نانومتر) ومربعات أصغر في الداخل بمقدار 0.05 نانومتر. يمكن للمرء استخدام المجهر لتحديد عدد الخلايا في أصغر مربع لتحديد عيار المحلول. — الشكل\(\PageIndex{7}\): (أ) حجرة Petrof-Hausser عبارة عن شريحة خاصة مصممة لحساب الخلايا البكتيرية في الحجم المقاس للعينة. تم حفر شبكة على الشريحة لتسهيل الدقة في العد. (ب) يوضح هذا الرسم البياني شبكة غرفة بيتروف-هاوسر، التي تتكون من مربعات من مناطق معروفة. يُظهر العرض الموسع المربع الذي يتم فيه حساب البكتيريا (الخلايا الحمراء). إذا كانت فتحة الغطاء أعلى بمقدار 0.2 مم من الشبكة وكانت مساحة المربع 0.04 مم ²، فإن الحجم يكون 0.008 مم ³ أو 0.000008 مل. نظرًا لوجود 10 خلايا داخل المربع، فإن كثافة البكتيريا تبلغ 10 خلايا/0.000008 مل، أي ما يعادل 1,250,000 خلية/مل. (المصدر: تعديل العمل من قبل جيفري إم فينوكور)

يجب حساب الخلايا في العديد من المربعات الصغيرة وأخذ المتوسط للحصول على قياس موثوق. تتمثل مزايا الغرفة في أن الطريقة سهلة الاستخدام وسريعة نسبيًا وغير مكلفة. على الجانب السلبي، لا تعمل غرفة العد بشكل جيد مع الثقافات المخففة لأنه قد لا تكون هناك خلايا كافية للعد.

لا يؤدي استخدام غرفة العد بالضرورة إلى حساب دقيق لعدد الخلايا الحية لأنه ليس من الممكن دائمًا التمييز بين الخلايا الحية والخلايا الميتة والحطام من نفس الحجم تحت المجهر. ومع ذلك، فإن تقنيات التلوين الفلوري المطورة حديثًا تجعل من الممكن التمييز بين البكتيريا الحية والميتة. ترتبط بقع الجدوى هذه (أو البقع الحية) بالأحماض النووية، لكن البقع الأولية والثانوية تختلف في قدرتها على عبور الغشاء السيتوبلازمي. يمكن للبقعة الأولية، التي تتألق باللون الأخضر، أن تخترق الأغشية السيتوبلازمية السليمة، وتلطيخ الخلايا الحية والميتة. يمكن للبقع الثانوية، التي تتألق باللون الأحمر، أن تلطخ الخلية فقط في حالة تلف الغشاء السيتوبلازمي بشكل كبير. وهكذا، تتألق الخلايا الحية باللون الأخضر لأنها تمتص البقعة الخضراء فقط، بينما تظهر الخلايا الميتة باللون الأحمر لأن البقعة الحمراء تزيح البقعة الخضراء على الأحماض النووية (الشكل\(\PageIndex{8}\)).

صورة مجهرية للعديد من الخلايا الخضراء المتوهجة وبعض الخلايا الحمراء المتوهجة. — الشكل\(\PageIndex{8}\): يمكن استخدام التلوين الفلوري للتمييز بين الخلايا البكتيرية الحية والميتة في العينة لأغراض العد. يتم تلوين الخلايا القابلة للحياة باللون الأخضر، في حين أن الخلايا الميتة ملطخة باللون الأحمر. (مصدر: تعديل العمل من قبل بانسيري إس، كونا سي، داليساندرو تي، ساندري إم، جيافاريسي جي، ماراتشي إم، هونغ سي تي، تامبيري أ)

تستخدم تقنية أخرى جهاز عد الخلايا الإلكتروني (عداد كولتر) لاكتشاف وحساب التغيرات في المقاومة الكهربائية في محلول ملحي. يتم غمر أنبوب زجاجي بفتحة صغيرة في محلول إلكتروليت. يتم تعليق القطب الأول في الأنبوب الزجاجي. يوجد قطب كهربائي ثانٍ خارج الأنبوب. عندما يتم سحب الخلايا من خلال الفتحة الصغيرة في الأنبوب الزجاجي، فإنها تغير لفترة وجيزة المقاومة المقاسة بين القطبين ويتم تسجيل التغيير بواسطة مستشعر إلكتروني (الشكل\(\PageIndex{9}\))؛ كل تغيير في المقاومة يمثل خلية. الطريقة سريعة ودقيقة ضمن نطاق من التركيزات؛ ومع ذلك، إذا كانت الثقافة مركزة جدًا، فقد تمر أكثر من خلية عبر الفتحة في أي وقت وتحرف النتائج. لا تفرق هذه الطريقة أيضًا بين الخلايا الحية والميتة.

توفر عمليات العد المباشر تقديرًا لإجمالي عدد الخلايا في العينة. ومع ذلك، في كثير من الحالات، من المهم معرفة عدد الخلايا الحية أو القابلة للحياة. هناك حاجة إلى تعداد الخلايا الحية عند تقييم مدى العدوى، وفعالية المركبات المضادة للميكروبات والأدوية، أو تلوث الطعام والماء.

أ) رسم تخطيطي لعداد كولتر. يتضمن هذا كوبًا به كرات صغيرة تشير إلى الخلايا. يتم تقسيم الكأس لإنشاء منطقة ذات شحنة موجبة ومنطقة شحنة سالبة. تنتقل الخلايا من المنطقة الإيجابية إلى المنطقة السلبية. يمكن للجهاز قياس عدد الخلايا التي تعبر من جانب إلى آخر. ب) صورة لهذا الجهاز تشبه كوبًا زجاجيًا صغيرًا. — الشكل\(\PageIndex{9}\): عداد كولتر هو جهاز إلكتروني يقوم بحساب الخلايا. يقيس التغير في المقاومة في محلول الإلكتروليت الذي يحدث عندما تمر الخلية عبر فتحة صغيرة في جدار الحاوية الداخلي. يقوم الكاشف تلقائيًا بحساب عدد الخلايا التي تمر عبر الفتحة. (المرجع ب: تعديل العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة)

التمارين\(\PageIndex{5}\)

لماذا تحسب عدد الخلايا في أكثر من مربع واحد في غرفة Petroff-Hausser لتقدير أعداد الخلايا؟
في طريقة تلوين الجدوى، لماذا تظهر الخلايا الميتة باللون الأحمر؟

عدد اللوحات

عدد اللوحات القابلة للحياة، أو ببساطة عدد اللوحات، هو عدد الخلايا الحية أو الحية. يعتمد على مبدأ أن الخلايا القابلة للحياة تتكاثر وتؤدي إلى ظهور مستعمرات مرئية عند احتضانها في ظروف مناسبة للعينة. عادة ما يتم التعبير عن النتائج بوحدات تكوين مستعمرة لكل مليلتر (CFU/ml) بدلاً من خلايا لكل مليلتر لأن أكثر من خلية واحدة ربما هبطت في نفس المكان لتؤدي إلى ظهور مستعمرة واحدة. علاوة على ذلك، يصعب تفريق عينات البكتيريا التي تنمو في مجموعات أو سلاسل وقد تمثل مستعمرة واحدة عدة خلايا. توصف بعض الخلايا بأنها قابلة للحياة ولكنها غير قابلة للزرع ولن تشكل مستعمرات على وسائط صلبة. لكل هذه الأسباب، يعتبر عدد اللوحات القابلة للحياة تقديرًا منخفضًا للعدد الفعلي للخلايا الحية. لا تنتقص هذه القيود من فائدة الطريقة، التي توفر تقديرات لأعداد البكتيريا الحية.

عادةً ما يقوم علماء الأحياء الدقيقة بحساب اللوحات التي تحتوي على 30-300 مستعمرة. العينات ذات المستعمرات القليلة جدًا (300 <30) do not give statistically reliable numbers, and overcrowded plates (> مستعمرة) تجعل من الصعب حساب المستعمرات الفردية بدقة. كما أن الأعداد في هذا النطاق تقلل من حدوث أكثر من خلية بكتيرية واحدة تشكل مستعمرة واحدة. وبالتالي، فإن CFU المحسوبة أقرب إلى العدد الحقيقي للبكتيريا الحية في السكان.

هناك طريقتان شائعتان لتلقيح الألواح لإجراء عمليات العد القابلة للتطبيق: لوحة الصب وطرق لوحة الانتشار. على الرغم من أن إجراء التلقيح النهائي يختلف بين هاتين الطريقتين، إلا أن كلاهما يبدأ بتخفيف متسلسل للثقافة.

التخفيف التسلسلي

يعد التخفيف التسلسلي للثقافة خطوة أولى مهمة قبل الشروع في طريقة صفيحة الصب أو لوحة الانتشار. الهدف من عملية التخفيف التسلسلي هو الحصول على لوحات تحتوي على وحدات CFU في حدود 30-300، وعادة ما تتضمن العملية العديد من التخفيفات بمضاعفات 10 لتبسيط الحساب. يتم اختيار عدد التخفيفات التسلسلية وفقًا لتقدير أولي لكثافة الثقافة. \(\PageIndex{10}\)يوضح الشكل طريقة التخفيف التسلسلي.

رسم تخطيطي للتخفيف التسلسلي. يحتوي كوب كبير على اليسار على محلول داكن. يتم نقل 1 مل من هذا الكوب إلى أنبوب يحتوي على 9 مل من المرق. هذا الأنبوب مخفف بنسبة 1:10 وهو أخف في اللون من الكوب الأصلي. يتم وضع عينة من 0.1 مل من هذا الأنبوب على صفيحة أجار؛ المستعمرات كثيرة جدًا بحيث لا يمكن حسابها. يتم إخراج 1 مل من هذا الأنبوب ووضعه في أنبوب يحتوي على 9 مل من المرق. يتمتع هذا الأنبوب الآن بتخفيف قدره 1:100 عن الكوب الأصلي وهو أخف في اللون. 0.1 مل مطلي على طبق أجار ولا تزال المستعمرات كثيرة جدًا بحيث لا يمكن حسابها. يتم أخذ 1 مل من هذا الأنبوب ووضعه في أنبوب آخر يحتوي على 9 مل من المرق. يعد هذا الآن تخفيفًا بنسبة 1:1000 من الكوب الأصلي والأنبوب أخف من الأخير. يتم إخراج 0.1 مل من هذا الأنبوب ووضعه على طبق أجار؛ هناك 389 مستعمرة. يتم إخراج 1 مل من هذا الأنبوب ووضعه في أنبوب آخر يحتوي على 9 مل من المرق. يعد هذا الآن تخفيفًا بمقدار 1:10000 من الكوب الأصلي وهذا الأنبوب أخف من الأخير. يتم إخراج 0.1 مل من هذا الأنبوب ووضعه على طبق أجار؛ هناك 50 مستعمرة. يتم إخراج 1 مل من هذا الأنبوب ووضعه في أنبوب يحتوي على 9 مل من المرق. هذا هو التخفيف بنسبة 1:100000 من الكأس الأصلي وهذا هو الأنبوب الأخف على الإطلاق. يتم أخذ 0.1 مل من هذا الأنبوب ووضعه على لوحة أجار؛ هناك مستعمرتان. — الشكل\(\PageIndex{10}\): يتضمن التخفيف التسلسلي تمييع حجم ثابت من الخلايا الممزوجة بمحلول التخفيف باستخدام التخفيف السابق كلقاح. والنتيجة هي تخفيف الثقافة الأصلية بعامل ينمو بشكل كبير. (مصدر: تعديل العمل من قبل «Leberechtc» /ويكيميديا كومنز)

تتم إضافة حجم ثابت من المزرعة الأصلية، 1.0 مل، وخلطه جيدًا مع محلول أنبوب التخفيف الأول، والذي يحتوي على 9.0 مل من المرق المعقم. تمثل هذه الخطوة عامل تخفيف قدره 10، أو 1:10، مقارنة بالثقافة الأصلية. من هذا التخفيف الأول، يتم سحب نفس الحجم، 1.0 مل، وخلطه بأنبوب جديد سعة 9.0 مل من محلول التخفيف. عامل التخفيف الآن هو 1:100 مقارنة بالثقافة الأصلية. تستمر هذه العملية حتى يتم إنتاج سلسلة من التخفيفات التي ستثبت تركيز الخلية المطلوب للعد الدقيق. من كل أنبوب، يتم طلاء العينة على وسط صلب باستخدام طريقة صفيحة الصب (الشكل\(\PageIndex{11}\)) أو طريقة لوحة الانتشار (الشكل\(\PageIndex{12}\)). يتم تحضين اللوحات حتى تظهر المستعمرات. عادة ما يتم تحضير لوحين إلى ثلاثة من كل تخفيف ويتم حساب متوسط عدد المستعمرات المحسوبة على كل لوحة. في جميع الحالات، يعد الخلط الشامل للعينات مع وسيط التخفيف (لضمان توزيع الخلايا في الأنبوب عشوائيًا) أمرًا بالغ الأهمية للحصول على نتائج موثوقة.

رسم تخطيطي لطريقة صب الطبق. الخطوة 1 - يتم خلط العينة البكتيرية مع أجار دافئ (45-50 درجة مئوية). الخطوة 2 - يتم سكب العينة على طبق معقم. الخطوة 3 - يتم تدوير العينة للخلط والسماح لها بالتصلب. الخطوة 4 - يتم تحضين اللوحة حتى تنمو المستعمرات البكتيرية. — الشكل\(\PageIndex{11}\): في طريقة صفيحة الصب لعد الخلايا، تُخلط العينة في أجار سائل دافئ (45-50 درجة مئوية) يُسكب في طبق بتري معقم ويُخلط بعد ذلك عن طريق الدوران. يتم تكرار هذه العملية لكل تخفيف تسلسلي يتم تحضيره. يتم حساب المستعمرات الناتجة وتقديم تقدير لعدد الخلايا في المجلد الأصلي الذي تم أخذ عينات منه.

يتم استخدام عامل التخفيف لحساب عدد الخلايا في ثقافة الخلية الأصلية. في مثالنا، تم حساب ما معدله 50 مستعمرة على اللوحات التي تم الحصول عليها من التخفيف بنسبة 1:10000. نظرًا لأنه تم سحب 0.1 مل فقط من نظام التعليق على اللوحة، فإن المضاعف المطلوب لإعادة تكوين التركيز الأصلي هو 10 × 10000. عدد CFU لكل مل يساوي 50 × 100 × 10000 = 5،000،000. يقدر عدد البكتيريا في المزرعة بـ 5 ملايين خلية/مل. كان عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها من التخفيف بنسبة 1:1000 389، وهو أقل بكثير من 500 المتوقع بفارق 10 أضعاف في التخفيفات. هذا يسلط الضوء على مشكلة عدم الدقة عندما يكون عدد المستعمرات أكبر من 300 وأكثر من خلية بكتيرية واحدة تنمو في مستعمرة واحدة.

رسم تخطيطي لطريقة لوحة الانتشار. الخطوة 1 - يتم سكب عينة (0.1 مل) من مادة تخفيف بكتيرية على وسط صلب. الخطوة 2 - يتم توزيع العينة بالتساوي على السطح. الخطوة 3 - يتم تحضين اللوحة حتى تنمو المستعمرات البكتيرية على سطح الوسط. — الشكل\(\PageIndex{12}\): في طريقة لوحة الانتشار لحساب الخلايا، تُسكب العينة على أجار صلب ثم تُنشر باستخدام موزع معقم. يتم تكرار هذه العملية لكل تخفيف تسلسلي يتم تحضيره. يتم حساب المستعمرات الناتجة وتقديم تقدير لعدد الخلايا في عينات الحجم الأصلية.

قد لا تحتوي العينة المخففة جدًا - مياه الشرب، على سبيل المثال - على عدد كافٍ من الكائنات الحية لاستخدام أي من طرق حساب الصفائح الموصوفة. في مثل هذه الحالات، يجب تركيز العينة الأصلية بدلاً من تخفيفها قبل الطلاء. يمكن تحقيق ذلك باستخدام تعديل تقنية عدد اللوحات تسمى تقنية الترشيح الغشائي. يتم تصفية الأحجام المعروفة بالمكنسة الكهربائية بطريقة معقمة من خلال غشاء بحجم مسام صغير بما يكفي لاحتجاز الكائنات الحية الدقيقة. يتم نقل الغشاء إلى لوحة بتري تحتوي على وسيط نمو مناسب. يتم حساب المستعمرات بعد الحضانة. يتم حساب كثافة الخلية عن طريق قسمة عدد الخلايا على حجم السائل المفلتر.

رابط إلى التعلم

شاهد هذا الفيديو للحصول على عروض توضيحية للتخفيفات التسلسلية وتقنيات ألواح الانتشار.

الرقم الأكثر احتمالاً

عادة ما يكون عدد الكائنات الحية الدقيقة في العينات المخففة منخفضًا جدًا بحيث لا يمكن اكتشافه بواسطة طرق تعداد اللوحات الموصوفة حتى الآن. بالنسبة لهذه العينات، يستخدم علماء الأحياء الدقيقة بشكل روتيني طريقة الرقم الأكثر احتمالاً (MPN)، وهو إجراء إحصائي لتقدير عدد الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة في العينة. غالبًا ما تستخدم طريقة MPN لعينات الماء والغذاء، وتقوم بتقييم النمو القابل للاكتشاف من خلال ملاحظة التغيرات في التعكر أو اللون بسبب النشاط الأيضي.

التطبيق النموذجي لطريقة MPN هو تقدير عدد الكوليفورم في عينة من مياه البركة. الكوليفورم عبارة عن بكتيريا قضيبية سالبة الجرام تخمر اللاكتوز. يعتبر وجود القولونيات في الماء علامة على التلوث بالمواد البرازية. بالنسبة للطريقة الموضحة في الشكل\(\PageIndex{13}\)، يتم اختبار سلسلة من ثلاثة مخففات لعينة الماء عن طريق تلقيح خمسة أنابيب من مرق اللاكتوز تحتوي على 10 مل من العينة، وخمسة أنابيب مرق اللاكتوز مع عينة 1 مل، وخمسة أنابيب مرق اللاكتوز مع 0.1 مل من العينة. تحتوي أنابيب مرق اللاكتوز على مؤشر درجة الحموضة الذي يتغير لونه من الأحمر إلى الأصفر عند تخمير اللاكتوز. بعد التلقيح والحضانة، يتم فحص الأنابيب بحثًا عن مؤشر نمو القولون من خلال تغيير اللون في الوسائط من الأحمر إلى الأصفر. أظهرت المجموعة الأولى من الأنابيب (عينة 10 مل) نموًا في جميع الأنابيب؛ وأظهرت المجموعة الثانية من الأنابيب (1 مل) نموًا في أنبوبين من أصل خمسة؛ في المجموعة الثالثة من الأنابيب، لم يلاحظ أي نمو في أي من الأنابيب (تخفيف 0.1 مل). تتم مقارنة الأرقام 5 و 2 و 0 بالشكل B1 في الملحق B، والذي تم إنشاؤه باستخدام نموذج احتمالية لإجراء أخذ العينات. من قراءتنا للجدول، نستنتج أن 49 هو العدد الأكثر احتمالاً للبكتيريا لكل 100 مل من مياه البركة.

رسم تخطيطي يتم فيه تخفيف العينة الأصلية من مياه البركة إلى أنابيب تحتوي على مرق اللاكتوز (مرق وردي). يتم وضع 10 مل من العينة في كل من أنابيب مرق اللاكتوز الخمسة. تحصل 5 أنابيب أخرى على 1 مل لكل عينة. تحصل 5 أنابيب أخرى على 0.1 مل من العينة. بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، يتغير لون بعض الأنابيب. تحولت جميع الأنابيب الخمسة التي تحتوي على 10 مل من العينة إلى اللون الأصفر وتظهر الغاز في الأنبوب الداخلي الأصغر. تحول اثنان من الأنابيب الخمسة التي تحتوي على 1 مل من العينة الأصلية إلى اللون الأصفر وأظهر الغاز؛ 3 من هذه الأنابيب لا تزال وردية اللون. تظل جميع الأنابيب التي حصلت على 0.1 مل من العينة الأصلية وردية اللون. — الشكل\(\PageIndex{13}\): في الطريقة الأكثر احتمالاً، يتم تلقيح مجموعات من خمسة أنابيب من مرق اللاكتوز بثلاثة أحجام مختلفة من مياه البركة: 10 مل، 1 مل، و0.1 مل. يتم تقييم نمو البكتيريا من خلال تغيير لون المرق من الأحمر إلى الأصفر حيث يتم تخمير اللاكتوز.

التمارين\(\PageIndex{6}\)

ما هي وحدة تكوين المستعمرات؟
ما الطريقتان المستخدمتان بشكل متكرر لتقدير أعداد البكتيريا في عينات المياه؟

عدد الخلايا غير المباشرة

إلى جانب الطرق المباشرة لعد الخلايا، تُستخدم طرق أخرى، تعتمد على الكشف غير المباشر عن كثافة الخلايا، بشكل شائع لتقدير ومقارنة كثافات الخلايا في المزرعة. تتمثل الطريقة الأولى في قياس التعكر (التعكر) لعينة من البكتيريا في محلول سائل. يُطلق على أداة المختبر المستخدمة لقياس التعكر اسم مقياس الطيف الضوئي (الشكل\(\PageIndex{14}\)). في مقياس الطيف الضوئي، ينتقل شعاع الضوء من خلال تعليق بكتيري، ويقاس الضوء الذي يمر عبر التعليق بواسطة كاشف، ويتم تحويل كمية الضوء التي تمر عبر العينة وتصل إلى الكاشف إما إلى إرسال النسبة المئوية أو قيمة لوغاريتمية تسمى الامتصاص (الكثافة الضوئية). مع زيادة أعداد البكتيريا في نظام التعليق، تزداد العكارة أيضًا وتتسبب في وصول كمية أقل من الضوء إلى الكاشف. يرتبط انخفاض الضوء الذي يمر عبر العينة والوصول إلى الكاشف بانخفاض النسبة المئوية للإرسال وزيادة الامتصاص المقاسة بواسطة مقياس الطيف الضوئي.

يعد قياس التعكر طريقة سريعة لتقدير كثافة الخلية طالما أن هناك خلايا كافية في العينة لإنتاج التعكر. من الممكن ربط قراءات التعكر بالعدد الفعلي للخلايا من خلال إجراء تعداد صحيح للألواح المأخوذة من الثقافات التي لها مجموعة من قيم الامتصاص. باستخدام هذه القيم، يتم إنشاء منحنى المعايرة من خلال رسم التعكر كدالة لكثافة الخلية. بمجرد إنتاج منحنى المعايرة، يمكن استخدامه لتقدير أعداد الخلايا لجميع العينات التي تم الحصول عليها أو استزراعها في ظل ظروف مماثلة وبكثافات ضمن نطاق القيم المستخدمة لإنشاء المنحنى.

أ) صورة لمقياس الطيف الضوئي؛ جهاز مزود بلوحة مفاتيح ومكان لوضع العينة. ب) رسم تخطيطي يشرح كيف يقيس مقياس الطيف الضوئي التعكر. يمر مصدر الضوء عبر المنشور ويتم تحديد طول موجة واحد. إذا مر شعاع الضوء هذا عبر مرق شفاف، فإن معظم الضوء يصل إلى الكاشف. إذا مر شعاع الضوء هذا عبر عينة غائمة، فإن الكثير من الضوء ينعكس وينكسر ويصل القليل فقط من الضوء إلى الكاشف. — الشكل\(\PageIndex{14}\): (أ) يشيع استخدام مقياس الطيف الضوئي لقياس تعكر الخلايا البكتيرية المعلقة كمقياس غير مباشر لكثافة الخلية. (ب) يعمل مقياس الطيف الضوئي بتقسيم الضوء الأبيض من مصدر إلى طيف. يسمح مقياس الطيف الضوئي باختيار الطول الموجي للضوء لاستخدامه في القياس. تعتمد الكثافة الضوئية (التعكر) للعينة على الطول الموجي، لذلك بمجرد اختيار طول موجة واحد، يجب استخدامه باستمرار. يمر الضوء المفلتر عبر العينة (أو عنصر تحكم باستخدام وسيط فقط) ويتم قياس شدة الضوء بواسطة كاشف. تنتشر الخلايا الضوء الذي يمر إلى معلّق البكتيريا بطريقة تجعل جزءًا منه لا يصل أبدًا إلى الكاشف. يحدث هذا التشتت بدرجة أقل بكثير في أنبوب التحكم باستخدام الوسيط فقط. (المرجع: تعديل العمل من قبل هوانغ إتش إس، كيم إم إس؛ الاعتماد ب «صور أنبوب الاختبار»: تعديل العمل من قبل سوزان واكيم)

يعد قياس الوزن الجاف لعينة الاستزراع طريقة أخرى غير مباشرة لتقييم كثافة الاستزراع دون قياس عدد الخلايا بشكل مباشر. يجب تركيز نظام التعليق الخلوي المستخدم لقياس الوزن عن طريق الترشيح أو الطرد المركزي، وغسله، ثم تجفيفه قبل أخذ القياسات. يجب توحيد درجة التجفيف لحساب محتوى الماء المتبقي. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للكائنات الحية الدقيقة الخيطية، والتي يصعب تعدادها عن طريق العد المباشر أو القابل للحياة.

كما رأينا، يمكن أن تكون طرق تقدير أعداد الخلايا القابلة للحياة كثيفة العمالة وتستغرق وقتًا لأن الخلايا يجب أن تنمو. في الآونة الأخيرة، تم تطوير طرق غير مباشرة لقياس الخلايا الحية تكون سريعة وسهلة التنفيذ. تقيس هذه الطرق نشاط الخلية من خلال متابعة إنتاج المنتجات الأيضية أو اختفاء المواد المتفاعلة. يمكن مراقبة تكوين ثلاثي فوسفات الأدينوزين (ATP)، والتركيب الحيوي للبروتينات والأحماض النووية، واستهلاك الأكسجين لتقدير عدد الخلايا.

التمارين\(\PageIndex{7}\)

ما الغرض من منحنى المعايرة عند تقدير عدد الخلايا من قياسات التعكر؟
ما هي أحدث الطرق غير المباشرة لحساب الخلايا الحية؟

الأنماط البديلة لانقسام الخلايا

الانشطار الثنائي هو النمط الأكثر شيوعًا لانقسام الخلايا في بدائيات النواة، ولكنه ليس الوحيد. عادة ما تتضمن الآليات الأخرى الانقسام غير المتماثل (كما هو الحال في مهدها) أو إنتاج الجراثيم في الشعيرات الهوائية.

في بعض البكتيريا الزرقاء، قد تتراكم العديد من النيوكليويدات في خلية دائرية متضخمة أو على طول خيوط، مما يؤدي إلى توليد العديد من الخلايا الجديدة في وقت واحد. غالبًا ما تنفصل الخلايا الجديدة عن الفتيل الأصلي وتطفو بعيدًا في عملية تسمى التجزئة (الشكل\(\PageIndex{15}\)). يُلاحظ التجزؤ بشكل شائع في الأكتينوميسيتات، وهي مجموعة من البكتيريا اللاهوائية الإيجابية للجرام والتي توجد بشكل شائع في التربة. هناك مثال غريب آخر على انقسام الخلايا في بدائيات النواة، يذكرنا بالولادة الحية في الحيوانات، تعرضه البكتيريا العملاقة Epulopiscium. تنمو العديد من الخلايا الوليدة بشكل كامل في الخلية الأم، والتي تتفكك في النهاية، وتطلق الخلايا الجديدة إلى البيئة. قد تشكل الأنواع الأخرى امتدادًا ضيقًا طويلًا عند قطب واحد في عملية تسمى التبرعم. يتضخم طرف الامتداد ويشكل خلية أصغر، البرعم الذي ينفصل في النهاية عن الخلية الأم. يعتبر التبرعم أكثر شيوعًا في الخميرة (الشكل\(\PageIndex{15}\))، ولكنه يُلاحظ أيضًا في بكتيريا الأطراف الاصطناعية وبعض البكتيريا الزرقاء.

أ) صورة مجهرية تُظهر سلاسل من الكرات الخضراء. ب) صورة مجهرية تُظهر كرة أكبر مع كرة أصغر متصلة بها. يُطلق على المجال الأصغر اسم NE. تحتوي كل كرة من هذه المجالات على منطقة داكنة تسمى N. — الشكل\(\PageIndex{15}\): (أ) تتكاثر البكتيريا الزرقاء الخيطية، مثل تلك المصورة هنا، عن طريق التجزؤ. (ب) في هذا المجهر الإلكتروني، تظهر خلايا بكتيريا *Gemmata obscuriglobus* في مهدها. الخلية الأكبر هي الخلية الأم. تشير الملصقات إلى النواة (N) والغلاف النووي الذي لا يزال يتشكل (NE) للخلية البنت. (المصدر أ: تعديل العمل من قبل CSIRO؛ الائتمان ب: تعديل العمل من قبل كوو-تشانغ لي، وريك آي ويب، وجون أ. فويرست)

تنمو بكتيريا Actinomyces في التربة في خيوط طويلة مقسمة على حواجز، على غرار الفطريات الموجودة في الفطريات، مما ينتج عنه خلايا طويلة ذات نواة متعددة. تؤدي الإشارات البيئية، التي ربما تتعلق بانخفاض توافر المغذيات، إلى تكوين خيوط هوائية. داخل هذه الشعيرات الهوائية، تنقسم الخلايا الممدودة في وقت واحد. تتطور الخلايا الجديدة، التي تحتوي على نواة واحدة، إلى جراثيم تؤدي إلى ظهور مستعمرات جديدة.

التمارين\(\PageIndex{8}\)

حدد فرقًا واحدًا على الأقل بين التجزئة والتمهيد.

الأفلام الحيوية

في الطبيعة، تنمو الكائنات الحية الدقيقة بشكل أساسي في الأغشية الحيوية والنظم البيئية المعقدة والديناميكية التي تتشكل على مجموعة متنوعة من الأسطح البيئية، من القنوات الصناعية وخطوط أنابيب معالجة المياه إلى الصخور في قاع الأنهار. ومع ذلك، لا تقتصر الأغشية الحيوية على ركائز الأسطح الصلبة. سيؤدي أي سطح تقريبًا في بيئة سائلة تحتوي على بعض العناصر الغذائية البسيطة في النهاية إلى تطوير فيلم حيوي. الحصائر الميكروبية التي تطفو على الماء، على سبيل المثال، عبارة عن أغشية حيوية تحتوي على مجموعات كبيرة من الكائنات الحية الدقيقة التي تقوم بعملية التمثيل الضوئي. قد تحتوي الأغشية الحيوية الموجودة في فم الإنسان على مئات الأنواع البكتيرية. بغض النظر عن البيئة التي توجد فيها، فإن الأغشية الحيوية ليست مجموعات عشوائية من الكائنات الحية الدقيقة؛ بل هي مجتمعات منظمة للغاية توفر ميزة انتقائية للكائنات الحية الدقيقة المكونة لها.

هيكل بيوفيلم

أظهرت الملاحظات باستخدام الفحص المجهري متحد البؤرة أن الظروف البيئية تؤثر على البنية العامة للأفلام الحيوية. تتشكل الأغشية الحيوية الخيطية التي تسمى اللافتات في المياه المتدفقة بسرعة، مثل تيارات المياه العذبة، والدوامات، وخلايا التدفق المختبري المصممة خصيصًا والتي تكرر ظروف النمو في السوائل سريعة الحركة. يتم تثبيت اللافتات على الركيزة بواسطة «رأس» ويطفو «الذيل» في اتجاه مجرى النهر في التيار. في المياه الساكنة أو البطيئة الحركة، تتخذ الأغشية الحيوية بشكل أساسي شكلًا يشبه الفطر. قد تتغير بنية الأغشية الحيوية أيضًا مع الظروف البيئية الأخرى مثل توافر المغذيات.

تكشف الملاحظات التفصيلية للأغشية الحيوية تحت الليزر متحد البؤرة ومجهر المسح الإلكتروني عن مجموعات من الكائنات الحية الدقيقة المضمنة في مصفوفة تتخللها قنوات المياه المفتوحة. تتكون المصفوفة خارج الخلية من مواد بوليمرية خارج الخلية (EPS) تفرزها الكائنات الحية في البيوفيلم. تمثل المصفوفة خارج الخلية جزءًا كبيرًا من البيوفيلم، حيث تمثل 50٪ - 90٪ من إجمالي الكتلة الجافة. تختلف خصائص EPS وفقًا للكائنات الحية والظروف البيئية.

EPS هو جل رطب يتكون أساسًا من السكريات ويحتوي على جزيئات كبيرة أخرى مثل البروتينات والأحماض النووية والدهون. إنها تلعب دورًا رئيسيًا في الحفاظ على سلامة ووظيفة البيوفيلم. تسمح القنوات في EPS بحركة العناصر الغذائية والنفايات والغازات في جميع أنحاء البيوفيلم. هذا يحافظ على ترطيب الخلايا ويمنع الجفاف. تحمي EPS أيضًا الكائنات الحية في البيوفيلم من افتراس الميكروبات أو الخلايا الأخرى (مثل البروتوزوان وخلايا الدم البيضاء في جسم الإنسان).

تشكيل البيوفيلم

تسمى الخلايا الميكروبية العائمة التي تعيش في بيئة مائية بخلايا العوالق. يتضمن تكوين البيوفيلم أساسًا ربط الخلايا العوالق بالركيزة، حيث تصبح لامسة (متصلة بالسطح). يحدث هذا على مراحل، كما هو موضح في الشكل\(\PageIndex{16}\). تتضمن المرحلة الأولى ربط الخلايا العوالق بسطح مطلي بغشاء تكييف من المواد العضوية. في هذه المرحلة، يمكن عكس الارتباط بالركيزة، ولكن عندما تعبر الخلايا عن أنماط ظاهرية جديدة تسهل تكوين EPS، فإنها تنتقل من نمط الحياة العوالق إلى نمط الحياة اللاذع. يطور البيوفيلم هياكل مميزة، بما في ذلك مصفوفة واسعة وقنوات مائية. تتفاعل الزوائد مثل الفيمبريا والقشريات والسوط مع EPS، ويشير الفحص المجهري والتحليل الجيني إلى أن مثل هذه الهياكل مطلوبة لإنشاء غشاء حيوي ناضج. في المرحلة الأخيرة من دورة حياة البيوفيلم، تعود الخلايا الموجودة على محيط البيوفيلم إلى نمط حياة العوالق، فتزيل الأغشية الحيوية الناضجة لاستعمار مواقع جديدة. يشار إلى هذه المرحلة بالتشتت.

داخل البيوفيلم، تنشئ أنواع مختلفة من الكائنات الحية الدقيقة تعاونًا استقلابيًا يصبح فيه منتج نفايات كائن حي ما مغذيًا لشخص آخر. على سبيل المثال، تستهلك الكائنات الحية الدقيقة الهوائية الأكسجين، مما يخلق مناطق لاهوائية تعزز نمو اللاهوائيات. يحدث هذا في العديد من حالات العدوى متعددة الميكروبات التي تشمل كل من مسببات الأمراض الهوائية واللاهوائية.

تسمى الآلية التي تقوم من خلالها الخلايا في البيوفيلم بتنسيق أنشطتها استجابة للمنبهات البيئية باستشعار النصاب. يمكّن استشعار النصاب - الذي يمكن أن يحدث بين خلايا الأنواع المختلفة داخل الغشاء الحيوي - الكائنات الحية الدقيقة من اكتشاف كثافة خلاياها من خلال إطلاق وربط جزيئات صغيرة قابلة للانتشار تسمى المحرضات التلقائية. عندما تصل مجموعة الخلايا إلى عتبة حرجة (النصاب القانوني)، تبدأ هذه المحرضات التلقائية سلسلة من التفاعلات التي تنشط الجينات المرتبطة بالوظائف الخلوية والتي تكون مفيدة فقط عندما يصل السكان إلى كثافة حرجة. على سبيل المثال، في بعض مسببات الأمراض، يبدأ تخليق عوامل الضراوة فقط عند وجود خلايا كافية لتطغى على الدفاعات المناعية للمضيف. على الرغم من أن معظم الدراسات تتم على المجموعات البكتيرية، إلا أن استشعار النصاب يحدث بين البكتيريا وحقيقيات النواة وبين الخلايا حقيقية النواة مثل فطر Candida albicans، وهو عضو شائع في الميكروبات البشرية التي يمكن أن تسبب العدوى لدى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة.

تنتمي جزيئات الإشارة في استشعار النصاب إلى فئتين رئيسيتين. تتواصل البكتيريا سالبة الجرام بشكل أساسي باستخدام لاكتونات الهوموسيرين التي تحتوي على N-acylated، بينما تستخدم البكتيريا الإيجابية للجرام في الغالب الببتيدات الصغيرة (الشكل\(\PageIndex{17}\)). في جميع الحالات، تتكون الخطوة الأولى في استشعار النصاب من ربط المحفز التلقائي بمستقبله المحدد فقط عند الوصول إلى الحد الأدنى لتركيز جزيئات الإشارة. بمجرد حدوث الارتباط بالمستقبل، تؤدي سلسلة من أحداث الإشارة إلى تغييرات في التعبير الجيني. والنتيجة هي تنشيط الاستجابات البيولوجية المرتبطة باستشعار النصاب، ولا سيما زيادة إنتاج جزيئات الإشارة نفسها، ومن هنا جاء مصطلح التحفيز التلقائي.

يحتوي الببتيد القصير على الأحماض الأمينية التالية في سلسلة: Tyr، ser، thr، cys، asp، phe، ile، met. يُلحق بـ cys حرف S، ويُلحق بـ S حرف C الذي يتم توصيله أيضًا بجهاز الاستقبال. يحتوي C أيضًا على O مزدوج الارتباط. يحتوي لاكتون هوموسيرين أسيتيل N-على خماسي مع O في الزاوية اليسرى السفلية و O مرتبط بالركن الأيسر. يتم توصيل الزاوية العلوية بحرف N المرتبط بحرف R و C. يتم ربط C بشكل مزدوج بـ O وله أيضًا حرف H. — الشكل\(\PageIndex{17}\): تعمل الببتيدات القصيرة في البكتيريا الموجبة للجرام ولاكتونات الهوموسيرين ذات الأسيتيل في البكتيريا سالبة الجرام كمحفزات تلقائية في استشعار النصاب وتتوسط في الاستجابة المنسقة للخلايا البكتيرية. تعتبر السلسلة الجانبية R من لاكتون الهوموسيرين النيتل N-acetylated خاصة بأنواع البكتيريا سالبة الجرام. يتم التعرف على بعض لاكتونات الهوموسيرين التي يتم إفرازها من قبل أكثر من نوع واحد.

الأفلام الحيوية وصحة الإنسان

يحتوي جسم الإنسان على العديد من أنواع الأغشية الحيوية، بعضها مفيد وبعضها ضار. على سبيل المثال، تلعب طبقات الميكروبات الطبيعية المبطنة للغشاء المخاطي المعوي والجهاز التنفسي دورًا في درء العدوى بمسببات الأمراض. ومع ذلك، يمكن أن يكون للأغشية الحيوية الأخرى في الجسم تأثير ضار على الصحة. على سبيل المثال، اللويحة التي تتشكل على الأسنان عبارة عن فيلم حيوي يمكن أن يساهم في أمراض الأسنان واللثة. يمكن أن تتكون الأغشية الحيوية أيضًا في الجروح، مما يتسبب أحيانًا في التهابات خطيرة يمكن أن تنتشر. غالبًا ما تستعمر بكتيريا Pseudomonas aeruginosa الأغشية الحيوية في الشعب الهوائية لمرضى التليف الكيسي، مما يتسبب في التهابات مزمنة وأحيانًا مميتة في الرئتين. يمكن أن تتكون الأغشية الحيوية أيضًا على الأجهزة الطبية المستخدمة في الجسم أو عليه، مما يسبب التهابات في المرضى الذين يعانون من القسطرة الداخلية أو المفاصل الاصطناعية أو العدسات اللاصقة.

تُظهر مسببات الأمراض المضمنة في الأغشية الحيوية مقاومة أعلى للمضادات الحيوية مقارنة بنظيراتها العائمة. تم اقتراح العديد من الفرضيات لشرح السبب. تكون الخلايا الموجودة في الطبقات العميقة من البيوفيلم غير نشطة في التمثيل الغذائي وقد تكون أقل عرضة لعمل المضادات الحيوية التي تعطل أنشطة التمثيل الغذائي. قد يؤدي EPS أيضًا إلى إبطاء انتشار المضادات الحيوية والمطهرات، مما يمنعها من الوصول إلى الخلايا في الطبقات العميقة من البيوفيلم. قد تساهم التغييرات المظهرية أيضًا في زيادة المقاومة التي تظهرها الخلايا البكتيرية في الأغشية الحيوية. على سبيل المثال، ثبت أن زيادة إنتاج مضخات التدفق، وهي بروتينات مدمجة في الأغشية تعمل بنشاط على إخراج المضادات الحيوية من الخلايا البكتيرية، هي آلية مهمة لمقاومة المضادات الحيوية بين البكتيريا المرتبطة بالأغشية الحيوية. أخيرًا، توفر الأغشية الحيوية بيئة مثالية لتبادل الحمض النووي خارج الكروموسومات، والذي غالبًا ما يتضمن جينات تمنح مقاومة للمضادات الحيوية.

التمارين\(\PageIndex{9}\)

ما الذي تتكون منه مصفوفة البيوفيلم؟
ما هو دور استشعار النصاب في البيوفيلم؟

المفاهيم الأساسية والملخص

تنقسم معظم الخلايا البكتيرية عن طريق الانشطار الثنائي. يُعرَّف وقت الجيل في نمو البكتيريا بأنه وقت مضاعفة السكان.
تتبع الخلايا في النظام المغلق نمط النمو بأربع مراحل: التأخر واللوغاريتمي (الأسي) والثابت والموت.
يمكن حساب الخلايا من خلال عدد الخلايا المباشر القابل للحياة. تُستخدم طرق صفيحة الصب ولوحة الانتشار لوضع التخفيفات التسلسلية داخل الأجار أو عليه، على التوالي، للسماح بحساب الخلايا القابلة للحياة التي تؤدي إلى تكوين وحدات تكوين المستعمرات. يتم استخدام الترشيح الغشائي لحساب الخلايا الحية في المحاليل المخففة. تسمح طريقة رقم الخلية الأكثر احتمالاً (MPN) بتقدير أعداد الخلايا في الثقافات دون استخدام وسائط صلبة.
يمكن استخدام الطرق غير المباشرة لتقدير كثافة الاستزراع عن طريق قياس تعكر الثقافة أو كثافة الخلايا الحية عن طريق قياس النشاط الأيضي.
تشمل الأنماط الأخرى لانقسام الخلايا التكوين النووي المتعدد في الخلايا؛ والانقسام غير المتماثل، كما هو الحال في مهدها؛ وتشكيل الأنابيب والجراثيم الطرفية.
الأغشية الحيوية هي مجتمعات من الكائنات الحية الدقيقة المتداخلة في مصفوفة من المواد البوليمرية خارج الخلية. يحدث تكوين البيوفيلم عندما تلتصق خلايا العوالق بالركيزة وتصبح لامسة. تقوم الخلايا في الأغشية الحيوية بتنسيق نشاطها من خلال التواصل من خلال استشعار النصاب.
توجد الأغشية الحيوية بشكل شائع على الأسطح في الطبيعة وفي جسم الإنسان، حيث قد تكون مفيدة أو تسبب التهابات شديدة. غالبًا ما تكون مسببات الأمراض المرتبطة بالأغشية الحيوية أكثر مقاومة للمضادات الحيوية والمطهرات.