Skip to main content
Global

20.5: טכניקות נוגדן אוטומטי פלואורסצנטי

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    209044

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    מטרות למידה

    • תאר את היתרונות של מבחני נוגדנים אימונופלואורסצנטיים בהשוואה למבחנים לא פלואורסצנטיים
    • השווה מבחני נוגדנים פלואורסצנטיים ישירים ועקיפים
    • הסבר כיצד ניתן להשתמש בציטומטר זרימה כדי לכמת תת-קבוצות ספציפיות של תאים הקיימים בתערובת מורכבת של סוגי תאים
    • הסבר כיצד ניתן להשתמש בסדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות להפרדת סוגים ייחודיים של תאים

    הדמיה מהירה של חיידקים מדגימה קלינית כגון ספוגית גרון או כיח יכולה להיות מושגת באמצעות טכניקות נוגדן פלואורסצנטי (FA) המחברות סמן פלואורסצנטי (פלואורוגן) לאזור הקבוע של נוגדן, וכתוצאה מכך מולקולת כתב מהירה לשימוש, קל לראות או למדוד, ומסוגל להיקשר לסמני מטרה עם ספציפיות גבוהה. אנו יכולים גם לתייג תאים, מה שמאפשר לנו לכמת במדויק תת-קבוצות מסוימות של תאים או אפילו לטהר תת-קבוצות אלה למחקר נוסף.

    בדומה למבחני האנזים, שיטות FA עשויות להיות ישירות, שבהן mAb מסומן קושר אנטיגן, או עקיף, שבו נוגדנים פוליקלונליים משניים קושרים נוגדנים של חולים המגיבים לאנטיגן מוכן. יישומים של שתי שיטות אלה הודגמו באיור 2.3.8. שיטות FA משמשות גם במערכות ספירת תאים ומיון אוטומטיות כדי למנות או להפריד תת-אוכלוסיות מסומנות של תאים במדגם.

    טכניקות נוגדן פלואורסצנטי ישיר

    בדיקות נוגדנים פלואורסצנטיים ישירים (DFA) משתמשות ב-mAb שכותרתו פלואורסצנטית כדי לקשור ולהאיר אנטיגן מטרה. בדיקות DFA שימושיות במיוחד לאבחון מהיר של מחלות חיידקיות. לדוגמה, ניתן להשתמש בנוגדנים המסומנים בפלואורסצנטיות נגד סטרפטוקוקוס פיוגנים (דלקת קבוצה A) כדי לקבל אבחנה של דלקת גרון מספוגית גרון. האבחנה מוכנה תוך דקות ספורות, וניתן להתחיל את המטופל באנטיביוטיקה עוד לפני שעזב את המרפאה. טכניקות DFA עשויות לשמש גם לאבחון דלקת ריאות הנגרמת על ידי Mycoplasma pneumoniae או Legionella pneumophila מדגימות כיח (איור). \(\PageIndex{1}\) הנוגדנים הפלואורסצנטיים נקשרים לחיידקים בשקופית מיקרוסקופ, ומאפשרים זיהוי מוכן של החיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לפיכך, טכניקת DFA היא בעלת ערך להדמיה של חיידקים מסוימים שקשה לבודד או לתרבות מדגימות המטופל.

    מיקרוגרף עם מוטות ירוקים זוהרים המסומנים בנוגדן שכותרתו פלואורסצין המחובר לבצילי הלגיונלה.
    איור\(\PageIndex{1}\): mAb פלואורסצנטי ירוק נגד L. pneumophila משמש כאן כדי לדמיין ולזהות חיידקים ממריחה של דגימה מדרכי הנשימה של חולה דלקת ריאות. (קרדיט: שינוי העבודה על ידי האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה)

    תרגיל \(\PageIndex{1}\)

    בבדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים ישירה, למה נקשר הנוגדן הפלואורסצנטי?

    טכניקות נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים

    בדיקות נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים (IFA\(\PageIndex{2}\)) (איור) משמשות לחיפוש נוגדנים בסרום המטופל. לדוגמה, בדיקת IFA לאבחון עגבת משתמשת בתאי T. pallidum מבודדים מחיה מעבדה (לא ניתן לגדל את החיידקים על אמצעי מעבדה) ומריחה שהוכנה על שקופית זכוכית. סרום החולה מתפשט על המריחה ונוגדנים אנטי-טרפונמליים, אם קיימים, רשאים להיקשר. הסרום נשטף ומוסיפים נוגדן משני. הנוגדן המשני הוא אימונוגלובולין אנטי-אנושי המצומד לפלואורוגן. בבדיקה, חיידקי T. pallidum יהיו גלויים רק אם הם נקשרו על ידי הנוגדנים מהסרום של המטופל.

    בדיקת IFA לעגבת מספקת השלמה חשובה לבדיקת VDRL שנדונה באיתור מתחמי אנטיגן-נוגדנים. ה- VDRL נוטה יותר ליצור תגובות חיוביות שגויות מאשר בדיקת IFA; עם זאת, ה- VDRL הוא מבחן טוב יותר לקביעת האם זיהום פעיל כיום.

    בדיקות IFA מועילות גם לאבחון מחלות אוטואימוניות. לדוגמה, זאבת אדמנתית מערכתית (SLE) (ראה הפרעות אוטואימוניות) מאופיינת ברמות ביטוי גבוהות של נוגדנים אנטי-גרעיניים (ANA). נוגדנים עצמיים אלה יכולים לבוא לידי ביטוי כנגד מגוון חלבונים המחייבים DNA ואפילו נגד ה- DNA עצמו. מכיוון שלעתים קרובות קשה לאבחן אוטואימוניות, במיוחד בשלב מוקדם של התקדמות המחלה, בדיקת ANA יכולה להיות רמז רב ערך באבחון ובהתחלת טיפול מתאים.

    ה- IFA עבור ANA מתחיל בקיבוע תאים הגדלים בתרבית לשקופית זכוכית והפיכתם לחדירים לנוגדן. השקופיות מודגרות לאחר מכן עם דילולים סדרתיים של סרום מהמטופל. לאחר הדגירה, השקופית נשטפת כדי להסיר חלבונים לא מאוגדים, והנוגדן הפלואורסצנטי (IgG אנטי אנושי מצומד לפלואורוגן) מתווסף. לאחר דגירה ושטיפה, התאים ניתן לבדוק עבור פלואורסצנטיות ניכרת סביב הגרעין (איור\(\PageIndex{3}\)). הטיטר של ANA בסרום נקבע על ידי הדילול הגבוה ביותר המראה פלואורסצנטיות. מכיוון שאנשים בריאים רבים מבטאים ANA, המכללה האמריקאית לראומטולוגיה ממליצה כי הטיטר חייב להיות לפחות 1:40 בנוכחות תסמינים הכוללים שתי מערכות איברים או יותר כדי להיחשב כמעידים על SLE. 1

    תרשים של מבחן IFA. אנטיגנים קשורים למשטח. סרום החולה נוסף. אם קיימים הנוגדנים התואמים הם נקשרים לאנטיגן. נוסף נוגדן משני (עם תווית פלואורסצנטית). אם הנוגדנים של המטופל קיימים הנוגדן המשני נקשר לנוגדנים של המטופל.
    איור\(\PageIndex{2}\): (א) בדיקת IFA משמשת לאיתור נוגדנים ספציפיים לאנטיגן על ידי כך שהיא מאפשרת להם להיקשר לאנטיגן קבוע למשטח ולאחר מכן להאיר קומפלקסים אלה עם מצומד נוגדן-פלואורוגן משני. (ב) בדוגמה זו של מיקרוגרף של בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים, נוגדנים של מטופל לנגיף החצבת נקשרים לאנטיגנים ויראליים הקיימים על תאים נגועים בחצבת מומתים המודבקים לשקופית. נוגדנים משניים קושרים את הנוגדנים של המטופל ונושאים מולקולה פלואורסצנטית. (קרדיט ב: שינוי העבודה על ידי האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה)
    שני מיקרוגרפים. לדגימה החולה יש אליפסות ירוקות זוהרות, השליטה הבריאה לא.
    איור\(\PageIndex{3}\): בבדיקה זו לנוגדנים אנטי-גרעיניים (ANA), תאים נחשפים לסרום מחולה החשוד בייצור ANA ולאחר מכן ל-mAb פלואורסצנטי ספציפי לאימונוגלובולין אנושי. כבקרה משתמשים גם בסרום מחולה בריא. פלואורסצנטיות גלויה סביב הגרעין מדגימה נוכחות של ANA בסרום של המטופל. בשליטה הבריאה בה מייצרים רמות נמוכות יותר של ANA, מתגלה ירוק קלוש מאוד. (אשראי משמאל, מימין: שינוי עבודות מאת אל-חוסייני AA, אלזהרני MD, אלניזי AS, סולימן NM, חאן MA, אלהרבי SA, צ'נטופי AA)

    תרגיל \(\PageIndex{2}\)

    1. בבדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים, למה נקשר הנוגדן הפלואורסצנטי?
    2. מה מחפש מבחן ANA?

    ציטומטריית זרימה

    ניתן להשתמש בנוגדנים המסומנים בפלואורסצנטית כדי לכמת תאים מסוג מסוים בתערובת מורכבת באמצעות ציטומטריית זרימה (איור\(\PageIndex{4}\)), מערכת אוטומטית, ספירת תאים המזהה תאים פלואורסצנטיים כשהם עוברים דרך צינור צר תא אחד בכל פעם. לדוגמה, בזיהומים ב- HIV, חשוב לדעת את רמת תאי ה- CD4 T בדם המטופל; אם המספרים נופלים מתחת ל -500 לכל μL של דם, המטופל נוטה יותר לרכוש זיהומים אופורטוניסטיים; מתחת ל -200 לכל μL, המטופל אינו יכול עוד להעלות תגובה חיסונית אדפטיבית מועילה כלל. הניתוח מתחיל על ידי דגירה של אוכלוסיית תאים מעורבים (למשל, תאי דם לבנים מתורם) עם mAb מסומן פלואורסצנטי ספציפי עבור תת אוכלוסייה של תאים (למשל, אנטי CD4). כמה ניסויים בוחנים שני סמני תאים בו זמנית על ידי הוספת פלואורוגן שונה ל-mAb המתאים. לאחר מכן התאים מוחדרים לציטומטר הזרימה דרך נימי צר שמאלץ את התאים לעבור בקובץ יחיד. לייזר משמש להפעלת הפלואורוגן. האור הפלואורסצנטי מקרין החוצה לכל הכיוונים, כך שניתן למקם את גלאי הפלואורסצנטיות בזווית מאור הלייזר הנכנס.

    איור \(\PageIndex{4}\) מציג את סרגל ההסתרה מול גלאי הפיזור קדימה המונע מאור לייזר לפגוע בגלאי. כאשר תא עובר דרך סרגל הלייזר, גלאי הפיזור קדימה מזהה אור המפוזר סביב סרגל ההסתרה. האור המפוזר הופך לדופק מתח, והציטומטר סופר תא. הקרינה מתא מסומן מזוהה על ידי גלאי פיזור הצד. האור עובר דרך מראות דיכרואיות שונות כך שהאור הנפלט מהפלואורופור מתקבל על ידי הגלאי הנכון.

    דגימת תא עוברת דרך זרבובית ומופרדת לתא ומעטפת זרימה בצינור בצד השני. לייזר פוגע בצינור זה בזווית של 90 מעלות ומתנתק לשני כיוונים, האחד עובר ישר ומתויג סרגל הסתרה, השני בזווית של 45 מעלות. ישנן 3 מראות דיכרואיות אשר מתנתקות ו -3 פילטרים. כל 5 הנתיבים מתכנסים ונשלחים לתחנת עבודה לניתוח.
    איור\(\PageIndex{4}\): בציטומטריית זרימה, תערובת של תאים עם תווית פלואורסצנטית וללא תווית עוברת דרך נימי צר. לייזר מרגש את הפלואורוגן, ועוצמת הקרינה של כל תא נמדדת על ידי גלאי. (קרדיט: שינוי העבודה על ידי "קיראנו" /ויקימדיה Commons)

    הנתונים נאספים הן מגלאי הפיזור קדימה והן מהצד. אחת הדרכים שניתן להציג נתונים אלה היא בצורה של היסטוגרמה. הפיזור קדימה ממוקם על ציר y (כדי לייצג את מספר התאים), ופיזור הצד ממוקם על ציר x (כדי לייצג את הפלואורסנס של כל תא). קנה המידה של ציר x הוא לוגריתמי, כך שעוצמת הפלואורסצנטיות עולה בפקטור של 10 כאשר כל יחידה עולה לאורך הציר. איור \(\PageIndex{5}\) מתאר דוגמה שבה תרבות של תאים משולבת עם נוגדן המחובר לפלואורופור כדי לזהות תאי CD8 ולאחר מכן מנותח על ידי ציטומטריית זרימה. ההיסטוגרמה כוללת שתי פסגות. לשיא משמאל יש קריאות פלואורסצנטיות נמוכות יותר, המייצגות את קבוצת המשנה של אוכלוסיית התאים (כ -30 תאים) שאינה זורחת; לפיכך, הם אינם קשורים לנוגדן ולכן אינם מבטאים CD8. לשיא מימין יש קריאות פלואורסצנטיות גבוהות יותר, המייצגות את קבוצת המשנה של אוכלוסיית התאים (כ-100 תאים) המראים פלואורסצנטיות; לפיכך, הם קשורים לנוגדן ולכן מבטאים CD8.

    גרף עם פלואורסצנטיות על ציר X וספירת תאים על ציר Y. השיא הראשון מגיע לכ- 30 ומתויג אל תבטא CD8. הפסגה השנייה מגיעה לכ- 100 והיא מסומנת do express CD8.
    איור\(\PageIndex{5}\): נתוני ציטומטריית זרימה נערכים לעתים קרובות כהיסטוגרמה. בהיסטוגרמה, השטח מתחת לכל שיא הוא פרופורציונלי למספר התאים בכל אוכלוסייה. ציר x הוא הקרינה היחסית המובעת על ידי התאים (בסולם יומן), וציר y מייצג את מספר התאים ברמה מסוימת של פלואורסצנטיות.

    תרגיל \(\PageIndex{3}\)

    1. מהי מטרת הלייזר בציטומטר זרימה?
    2. בפלט מציטומטר זרימה, השטח מתחת להיסטוגרמה שווה למה?

    מיקוד קליני: רזולוציה

    לאחר הודעה לכל 1300 החולים, בית החולים מתחיל לתזמן בדיקת HIV. פגישות נקבעו לפחות 3 שבועות לאחר ביקורו האחרון של המטופל בבית החולים כדי למזער את הסיכון לתשלילים כוזבים. מכיוון שצפויים כמה תוצאות חיוביות שגויות, רופא בריאות הציבור קבע פרוטוקול ייעוץ לכל מטופל ש- ELISA העקיף שלו חזר חיובי.

    מתוך 1300 החולים, שמונה נבדקו חיוביים באמצעות ELISA. חמש מהבדיקות הללו בוטלו על ידי בדיקות כתם מערביות שליליות, אך כתם מערבי אחד חזר חיובי, המאשר כי המטופל אכן נדבק ב- HIV. שני הכתמים המערביים הנותרים חזרו בלתי מוגדרים. אנשים אלה נאלצו להיכנע לבדיקה שלישית, PCR, כדי לאשר את נוכחותם או היעדרם של רצפי HIV. למרבה המזל, שני החולים נבדקו שליליים.

    באשר לחולה הבודד שאושר שיש לו HIV, הבדיקות אינן יכולות להוכיח או להפריך כל קשר למזרקים שנפגעו על ידי עובד בית החולים לשעבר. אף על פי כן, ביטוח בית החולים יכסה באופן מלא את הטיפול בחולה, שהחל מיד.

    למרות שיש לנו כיום תרופות שהן בדרך כלל יעילות בשליטה על התקדמות ה- HIV ואיידס, עדיין אין תרופה. אם הוא לא מטופל, או אם משטר התרופות נכשל, המטופל יחווה ירידה הדרגתית במספר תאי T עוזרים CD4, וכתוצאה מכך פגיעה קשה בכל תפקודי החיסון ההסתגלותיים. אפילו ירידות מתונות במספר תאי T עוזרים עלולות לגרום לחוסר חיסונים, ולהשאיר את המטופל רגיש לזיהומים אופורטוניסטיים. כדי לפקח על מצב תאי T העוזרים של המטופל, בית החולים ישתמש בציטומטריית זרימה. בדיקה רגישה זו מאפשרת לרופאים לקבוע במדויק את מספר תאי T עוזרים כדי שיוכלו להתאים את הטיפול אם המספר יורד מתחת ל -500 תאים/μL.

    מיון תאים באמצעות אימונופלואורסצנטי

    ציטומטר הזרימה ואימונופלואורסצנטי יכול גם להיות שונה כדי למיין תאים מדגימה אחת לתוך תת אוכלוסיות מטוהרות של תאים למטרות מחקר. שינוי זה של ציטומטר הזרימה נקרא סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS). ב-FACS, הקרינה על ידי תא גורמת למכשיר לשים מטען על טיפה של נוזל ההובלה המכיל את התא הזה. המטען ספציפי לאורך הגל של האור הפלואורסצנטי, המאפשר מיון דיפרנציאלי לפי אותם מטענים שונים. המיון מתבצע על ידי מסיט אלקטרוסטטי המניע את הטיפה הטעונה המכילה את התא לכלי איסוף כזה או אחר. התהליך מביא לתת-אוכלוסיות מטוהרות מאוד של תאים.

    מגבלה אחת של FACS היא שזה עובד רק על תאים מבודדים. לפיכך, השיטה תעבוד במיון תאי דם לבנים, מכיוון שהם קיימים כתאים מבודדים. אבל עבור תאים ברקמה, ציטומטריית זרימה יכולה להיות מיושמת רק אם נוכל לכרות את הרקמה ולהפריד אותה לתאים בודדים (באמצעות פרוטאזות כדי לבקע מולקולות הדבקה של תא-תא) מבלי לשבש את שלמות התא. ניתן להשתמש בשיטה זו בגידולים, אך לעתים קרובות יותר משתמשים באימונוהיסטוכימיה ואימונוציטוכימיה לחקר תאים ברקמות.

    קישור ללמידה

    צפה בסרטונים כדי ללמוד עוד על אופן הפעולה של ציטומטריית זרימה ו-FACS.

    תרגיל \(\PageIndex{4}\)

    במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, איזה מאפיין של תאי המטרה מאפשר להפריד ביניהם?

    הטבלה \(\PageIndex{1}\) משווה את המנגנונים של טכניקות הנוגדנים הפלואורסצנטיים שנדונו בסעיף זה.

    טבלה\(\PageIndex{1}\): טכניקות נוגדנים פלואורסצנטיים
    סוג הבדיקה מנגנון דוגמאות
    נוגדן פלואורסצנטי ישיר (DFA) משתמש בצימודים של פלואורוגן-נוגדנים כדי לתייג חיידקים מדגימות מטופלים הדמיה של לגיונלה פנאומופילה מתוך ספוגית גרון
    נוגדן פלואורסצנטי עקיף (IFA) מזהה נוגדנים ספציפיים למחלה בסרום הפטנטים אבחון עגבת; גילוי נוגדנים אנטי-גרעיניים (ANA) עבור זאבת ומחלות אוטואימוניות אחרות
    ציטומטריית זרימה מתייג ממברנות תאים עם סמנים מצומדים פלואורוגן-נוגדן הנרגשים על ידי לייזר; המכונה סופרת את התא ומתעדת את הפלואורסצנטיות היחסית ספירת מספר תאי CD4 או CD8 המסומנים בפלואורסצנטית במדגם
    סדרן תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) צורה של ציטומטריית זרימה שגם סופרת תאים וגם מפרידה אותם פיזית לבריכות של תאים פלואורסצנטיים גבוהים ונמוכים מיון תאים סרטניים

    מושגי מפתח וסיכום

    • מבחני אימונופלואורסצנציה משתמשים בצימודי נוגדנים-פלואורוגן כדי להאיר אנטיגנים לזיהוי קל ומהיר.
    • ניתן להשתמש באימונופלואורסצנטי ישיר לאיתור נוכחות של חיידקים בדגימות קליניות כמו כיח.
    • אימונופלואורסצנטי עקיף מזהה נוכחות של נוגדנים ספציפיים לאנטיגן בסרה של המטופל. הנוגדן הפלואורסצנטי נקשר לנוגדן הספציפי לאנטיגן ולא לאנטיגן.
    • השימוש במבחני אימונופלואורסצנציה עקיפים לאיתור נוגדנים אנטי-גרעיניים הוא כלי חשוב באבחון של מספר מחלות אוטואימוניות.
    • ציטומטריית זרימה משתמשת ב-mAbs פלואורסצנטיים נגד חלבוני קרום התא כדי לכמת תת-קבוצות ספציפיות של תאים בתערובות מורכבות.
    • ממייני תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות הם הרחבה של ציטומטריית זרימה שבה עוצמת הקרינה משמשת להפרדה פיזית של תאים לאוכלוסיות פלואורסצנטיות גבוהות ונמוכות.

    הערות שוליים

    1. 1 גיל, ג'יימס מ ', אנה מ' קוויזל, פיטר ו 'רוקה ודנה טי וולטרס. "אבחון זאבת אדמנתית מערכתית." רופא משפחה אמריקאי 68, מס '11 (2003): 2179-2186.