2.3: מכשירי מיקרוסקופיה

Last updated
Save as PDF

Page ID: 209081

$ \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } $ $ \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} $$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$ $ \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$ $ \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$ $ \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$ $ \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$ $ \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$ $ \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$ $ \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$ $ \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$ $ \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$ $\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$ $ \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$ $ \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$ $ \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$ $ \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$ $ \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$ $ \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$ $ \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$ $ \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$ $ \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$$\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}$

מטרות למידה

זהה ותאר את החלקים של מיקרוסקופ שדה בהיר
חישוב הגדלה כוללת עבור מיקרוסקופ מורכב
תאר את המאפיינים המבדילים והשימושים האופייניים לסוגים שונים של מיקרוסקופי אור, מיקרוסקופים אלקטרונים ומיקרוסקופי בדיקה סריקה

החלוצים המוקדמים של המיקרוסקופיה פתחו צוהר לעולם הבלתי נראה של המיקרואורגניזמים. אבל המיקרוסקופיה המשיכה להתקדם במאות שלאחר מכן. בשנת 1830 יצר ג'וזף ג'קסון ליסטר מיקרוסקופ אור מודרני במהותו. במאה ה -20 התפתחו מיקרוסקופים שמנפו אור בלתי נראה, כגון מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המשתמש במקור אור אולטרה סגול, ומיקרוסקופ אלקטרונים, המשתמשת בקרני אלקטרונים באורך גל קצר. התקדמות זו הובילה לשיפורים משמעותיים בהגדלה, ברזולוציה ובניגודיות. לשם השוואה, המיקרוסקופים הבסיסיים יחסית של ואן לוונהוק ובני דורו היו הרבה פחות חזקים אפילו מהמיקרוסקופים הבסיסיים ביותר הנמצאים בשימוש כיום. בחלק זה נסקור את המגוון הרחב של טכנולוגיה מיקרוסקופית מודרנית ויישומים נפוצים לכל סוג מיקרוסקופ.

מיקרוסקופ אור

סוגים רבים של מיקרוסקופים נכללים בקטגוריה של מיקרוסקופי אור, המשתמשים באור כדי להמחיש תמונות. דוגמאות למיקרוסקופי אור כוללות מיקרוסקופים של שדה בהיר, מיקרוסקופים של שדה כהה, מיקרוסקופים עם ניגודיות פאזה, מיקרוסקופים של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות, מיקרוסקופים פלואורסצנטיים, מיקרוסקופי לייזר סריקה קונפוקלית ומיקרוסקופים דו-פוטונים. ניתן להשתמש בסוגים שונים של מיקרוסקופי אור כדי להשלים זה את זה באבחון ובמחקר.

מיקרוסקופים של ברייטפילד

מיקרוסקופ שדה בהיר, אולי הסוג הנפוץ ביותר של מיקרוסקופ, הוא מיקרוסקופ מורכב עם שתי עדשות או יותר המייצרות תמונה כהה על רקע בהיר. חלק מהמיקרוסקופים של שדה בהיר הם חד-עיניים (בעלי עינית אחת), אם כי רוב המיקרוסקופים החדשים יותר של שדה בהיר הם דו-עיניים (בעלי שתי עיניות), כמו זו המוצגת באיור$\PageIndex{1}$; בשני המקרים, כל עינית מכילה עדשה הנקראת עדשת עיניים. עדשות העין מגדילות בדרך כלל תמונות פי 10 (10). בקצה השני של צינור הגוף יש קבוצה של עדשות אובייקטיביות על פיסת האף המסתובבת. ההגדלה של עדשות אובייקטיביות אלה נעה בדרך כלל בין 4 ל 100, כאשר ההגדלה של כל עדשה מיועדת על מעטפת המתכת של העדשה. עדשות העין והאובייקטיביות פועלות יחד ליצירת תמונה מוגדלת. ההגדלה הכוללת היא תוצר ההגדלה העינית כפול ההגדלה האובייקטיבית:

\[\text{ocular magnification} \times \text{objective magnification} \nonumber\]

לדוגמה, אם נבחרה עדשה $40 \times$ אובייקטיבית והעדשה העינית היא$10\times$, ההגדלה הכוללת תהיה

\[(40×)(10×)=400× \nonumber\]

תמונה של מיקרוסקופ מוצגת. הבסיס מכיל מקור אור (המאיר, #7) וכפתור להתאמת עוצמת האור (ריאוסטט). בקצה אחד של הבסיס מחוברת זרוע עם במה (#9) להחזיק את הדגימה המוקרנת החוצה באמצע הזרוע. במרכז הבמה יש פתח המאפשר אור מהמאיר לעבור. מתחת לפתח זה נמצאים הסרעפת והקבל (#8). מעל פתח זה ארבע עדשות (עדשות אובייקטיביות, #3) על פיסת אף מסתובבת (#2) המחזיקה ביעדים המרובים. מעל העדשות האובייקטיביות שתי חתיכות עיניים (#1) הנקראות עדשות העין. לתחתית הבמה מחוברות שתי ידיות להזזת השקופית (ידיות במה מכניות x-y). על הזרוע מתחת לבמה 2 ידיות למיקוד התמונה. הכפתור הגדול יותר (#4) הוא המוקד הגס, והכפתור הקטן יותר (#5) הוא המוקד העדין. — איור$\PageIndex{1}$: רכיבים של מיקרוסקופ שדה בהיר טיפוסי.

רכיבים של מיקרוסקופ שדה בהיר טיפוסי.

הפריט הנצפה נקרא דגימה. הדגימה מונחת על שקופית זכוכית, אשר לאחר מכן נחתכת למקומה על הבמה (פלטפורמה) של המיקרוסקופ. לאחר השקופית מאובטחת, הדגימה בשקופית ממוקמת מעל האור באמצעות ידיות הבמה המכניות x-y. ידיות אלה מזיזות את השקופית על פני הבמה, אך אינן מרימות או מורידות את הבמה. ברגע שהדגימה מרוכזת מעל האור, ניתן להעלות או להוריד את מיקום הבמה כדי למקד את התמונה. כפתור המיקוד הגס משמש לתנועות בקנה מידה גדול עם עדשות אובייקטיביות 4ו- 10; כפתור המיקוד העדין משמש לתנועות בקנה מידה קטן, במיוחד עם עדשות אובייקטיביות 40או 100.

כאשר התמונות מוגדלות, הן הופכות עמומות יותר מכיוון שיש פחות אור ליחידת שטח של התמונה. תמונות מוגדלות מאוד המיוצרות על ידי מיקרוסקופים, לכן, דורשות תאורה אינטנסיבית. במיקרוסקופ שדה בהיר, אור זה מסופק על ידי מאיר, שהוא בדרך כלל נורה בעוצמה גבוהה מתחת לבמה. אור מהמאיר עובר דרך עדשת הקבל (הממוקמת מתחת לבמה), הממקדת את כל קרני האור בדגימה כדי למקסם את התאורה. ניתן לייעל את מיקום הקבל באמצעות ידית המיקוד המחוברת של הקבל; לאחר קביעת המרחק האופטימלי, אין להזיז את הקבל כדי להתאים את הבהירות. אם יש צורך ברמות אור פחות ממקסימום, ניתן לכוונן בקלות את כמות האור הפוגעת בדגימה על ידי פתיחה או סגירה של דיאפרגמה בין המעבה לדגימה. במקרים מסוימים ניתן לכוונן את הבהירות גם באמצעות ריאוסטט, מתג דימר השולט בעוצמת המאיר.

מיקרוסקופ שדה בהיר יוצר תמונה על ידי הפניית אור מהמאיר אל הדגימה; אור זה מועבר באופן דיפרנציאלי, נספג, מוחזר או נשבר על ידי מבנים שונים. צבעים שונים יכולים להתנהג בצורה שונה כאשר הם מתקשרים עם כרומופורים (פיגמנטים הסופגים ומשקפים אורכי גל מסוימים של אור) בחלקים מהדגימה. לעתים קרובות, chromophores מתווספים באופן מלאכותי לדגימה באמצעות כתמים, אשר משמשים להגברת הניגודיות והרזולוציה. באופן כללי, מבנים בדגימה ייראו כהים יותר, בהיקפים שונים, מהרקע הבהיר, ויצרו תמונות חדות ביותר בהגדלות של עד כ -100. הגדלה נוספת תיצור תמונה גדולה יותר, אך ללא רזולוציה מוגברת. זה מאפשר לנו לראות עצמים קטנים כמו חיידקים, הנראים בערך 400לערך, אך לא עצמים קטנים יותר כגון וירוסים.

בהגדלות גבוהות מאוד, הרזולוציה עלולה להיפגע כאשר האור עובר בכמות האוויר הקטנה בין הדגימה לעדשה. זאת בשל ההבדל הגדול בין מדדי השבירה של אוויר וזכוכית; האוויר מפזר את קרני האור לפני שהם יכולים להיות ממוקדים על ידי העדשה. כדי לפתור בעיה זו, ניתן להשתמש בטיפת שמן למילוי החלל שבין הדגימה לעדשת טבילה בשמן, עדשה מיוחדת המיועדת לשימוש עם שמני טבילה. מכיוון שלשמן יש מקדם שבירה דומה מאוד לזה של זכוכית, הוא מגדיל את הזווית המרבית שבה אור שעוזב את הדגימה יכול לפגוע בעדשה. זה מגדיל את האור שנאסף, ובכך, את הרזולוציה של התמונה (איור$\PageIndex{2}$). ניתן להשתמש במגוון שמנים לסוגים שונים של אור.

תצלום א מראה תקריב של עדשה ממיקרוסקופ שדה בהיר. העדשה כמעט נוגעת בשקופית שמתחתיה ויש שמן המשתרע על החלל שבין העדשה לשקופית. תרשים ב אור העובר ממקור האור דרך שקופית המיקרוסקופ. ללא שמן, האור נשבר כשהוא עובר דרך הזכוכית. רבות מקרני האור השבורות הללו אינן פוגשות את עדשת המיקרוסקופ. עם שמן טבילה, קרני האור עוברות מהשקופית, דרך שמן הטבילה, אל עדשת המיקרוסקופ עם שבירה מינימלית. — איור$\PageIndex{2}$: (א) עדשות טבילה בשמן כמו זו משמשות לשיפור הרזולוציה. (ב) מכיוון שלשמן טבילה וזכוכית יש מדדי שבירה דומים מאוד, יש כמות שבירה מינימלית לפני שהאור מגיע לעדשה. ללא שמן טבילה, האור מתפזר כשהוא עובר באוויר מעל השקופית, ומשפיל את רזולוציית התמונה.

תחזוקת מיקרוסקופ: שיטות עבודה מומלצות

אפילו מיקרוסקופ חזק מאוד לא יכול לספק תמונות ברזולוציה גבוהה אם הוא לא מנוקה ומתוחזק כראוי. מכיוון שעדשות מעוצבות ומיוצרות בקפידה כדי לשבור אור ברמת דיוק גבוהה, אפילו עדשה מעט מלוכלכת או שרוטה תשבור אור בדרכים לא מכוונות, ותשפיל את תמונת הדגימה. בנוסף, מיקרוסקופים הם מכשירים עדינים למדי, ויש להקפיד מאוד להימנע מפגיעה בחלקים ובמשטחים. בין היתר, טיפול נאות במיקרוסקופ כולל את הדברים הבאים:

ניקוי העדשות בנייר עדשה
לא לאפשר לעדשות ליצור קשר עם השקופית (למשל, על ידי שינוי מהיר של המיקוד)
הגנה על הנורה (אם יש כזו) מפני שבירה
לא לדחוף מטרה לשקופית
לא משתמש בכפתור המיקוד הגס בעת שימוש בעדשות האובייקטיביות 40ומעלה
רק באמצעות שמן טבילה עם מטרת שמן מיוחדת, בדרך כלל המטרה 100
ניקוי שמן מעדשות טבילה לאחר השימוש במיקרוסקופ
ניקוי כל שמן שהועבר בטעות מעדשות אחרות
כיסוי המיקרוסקופ או הנחתו בארון כאשר אינו בשימוש

מיקרוסקופיה של דארקפילד

מיקרוסקופ שדה כהה הוא מיקרוסקופ שדה בהיר שיש לו שינוי קטן אך משמעותי במעבה. דיסק קטן ואטום (בקוטר של כ -1 ס"מ) ממוקם בין המאיר לעדשת הקבל. עצירת אור אטומה זו, כשמו כן הוא הדיסק, חוסמת את מרבית האור מהמאיר כשהוא עובר דרך הקבל בדרכו לעדשה האובייקטיבית, ומייצר חרוט אור חלול הממוקד בדגימה. האור היחיד שמגיע למטרה הוא אור שנשבר או הוחזר על ידי מבנים בדגימה. התמונה המתקבלת מציגה בדרך כלל אובייקטים בהירים על רקע כהה (איור$\PageIndex{3}$)

תרשים המציג את נתיב האור במיקרוסקופ שדה כהה. האור עובר ממקור האור לתחנת אור אטומה החוסמת את מרכז קרן האור. הקורות החיצוניות ממוקדות על ידי עדשת מעבה על המדגם בשקופית. הדגימה מפזרת חלק מהאור. עדשה אובייקטיבית נוספת חוסמת תאורה ישירה אך מעבירה אור מפוזר. — איור$\PageIndex{3}$: עצירת אור אטומה המוכנסת למיקרוסקופ שדה בהיר משמשת להפקת תמונת שדה כהה. עצירת האור חוסמת אור הנוסע ישירות מהמאיר לעדשה האובייקטיבית, ומאפשרת רק לאור המוחזר או נשבר מהדגימה להגיע לעין.

עצירת אור אטומה המוכנסת למיקרוסקופ שדה בהיר משמשת להפקת תמונת שדה כהה. עצירת האור חוסמת אור הנוסע ישירות מהמאיר לעדשה האובייקטיבית, ומאפשרת רק לאור המוחזר או נשבר מהדגימה להגיע לעין.

מיקרוסקופיה של Darkfield יכולה לעתים קרובות ליצור תמונות בעלות ניגודיות גבוהה ברזולוציה גבוהה של דגימות ללא שימוש בכתמים, דבר שימושי במיוחד לצפייה בדגימות חיות שעלולות להיהרג או להיפגע בדרך אחרת מהכתמים. לדוגמה, ניתן לראות בצורה הטובה ביותר ספירוצ'טים דקים כמו Treponema pallidum, הגורם הסיבתי של עגבת, באמצעות מיקרוסקופ שדה כהה (איור). $\PageIndex{4}$

מיקרוגרף מראה רקע שחור עם כמה ספירלות לבנות קטנות. — *איור$\PageIndex{4}$: שימוש במיקרוסקופ שדה כהה מאפשר לנו לצפות בדגימות חיות ולא מוכתמות של הספירוצ'ט Treponema pallidum.* בדומה לשלילה צילומית, הספירוצ'טים נראים בהירים על רקע כהה. (קרדיט: המרכז לבקרת מחלות ומניעתן)

שימוש במיקרוסקופ שדה כהה מאפשר לנו לצפות בדגימות חיות ולא מוכתמות של הספירוצ'ט Treponema pallidum. בדומה לשלילה צילומית, הספירוצ'טים נראים בהירים על רקע כהה. (קרדיט: מרכזים לבקרת מחלות ומניעה/CW האברד)

תרגיל $\PageIndex{1}$

זהה את ההבדלים העיקריים בין מיקרוסקופיה ברייטפילד ומיקרוסקופ שדה כהה.

מיקוד קליני: חלק 2

דלקות פצעים כמו של סינדי יכולות להיגרם על ידי סוגים רבים ושונים של חיידקים, שחלקם יכולים להתפשט במהירות עם סיבוכים רציניים. זיהוי הגורם הספציפי חשוב מאוד לבחירת תרופה שיכולה להרוג או לעצור את צמיחת החיידקים.

לאחר שהתקשרה לרופא מקומי בנוגע למקרה של סינדי, אחות המחנה שולחת את הדגימה מהפצע למעבדה הרפואית הקרובה ביותר. למרבה הצער, מכיוון שהמחנה נמצא באזור מרוחק, המעבדה הקרובה ביותר קטנה ומאובזרת בצורה גרועה. סביר להניח שמעבדה מודרנית יותר תשתמש בשיטות אחרות כדי לתרבות, לגדל ולזהות את החיידקים, אך במקרה זה, הטכנאי מחליט לבצע הרכבה רטובה מהדגימה ולצפות בה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. במתקן רטוב, טיפה קטנה של מים מתווספת למגלשה, והחלקת כיסוי מונחת מעל הדגימה כדי לשמור אותה במקומה לפני שהיא ממוקמת מתחת לעדשה האובייקטיבית.

מתחת למיקרוסקופ שדה הבהיר, הטכנאי בקושי יכול לראות את תאי החיידקים מכיוון שהם כמעט שקופים על הרקע הבהיר. כדי להגביר את הניגודיות, הטכנאי מכניס עצירת אור אטומה מעל המאיר. תמונת השדה האפל המתקבלת מראה בבירור שתאי החיידקים הם כדוריים ומקובצים באשכולות, כמו ענבים.

מדוע חשוב לזהות את הצורה ודפוסי הגדילה של תאים בדגימה?
באילו סוגים אחרים של מיקרוסקופיה ניתן להשתמש ביעילות לצפייה בדגימה זו?

מיקרוסקופים של ניגודיות פאזה

מיקרוסקופים עם ניגודיות פאזה משתמשים בשבירה והפרעות הנגרמות על ידי מבנים בדגימה כדי ליצור תמונות בעלות ניגודיות גבוהה ברזולוציה גבוהה ללא כתמים. זהו סוג המיקרוסקופ העתיק והפשוט ביותר שיוצר תמונה על ידי שינוי אורכי הגל של קרני האור העוברות בדגימה. כדי ליצור נתיבי אורך גל משתנים, נעשה שימוש בעצירה טבעתית במעבה. העצירה הטבעתית מייצרת חרוט חלול של אור הממוקד בדגימה לפני שהוא מגיע לעדשה האובייקטיבית. המטרה מכילה צלחת פאזה המכילה טבעת פאזה. כתוצאה מכך, אור הנוסע ישירות מהמאיר עובר דרך טבעת הפאזה בעוד אור שנשבר או מוחזר על ידי הדגימה עובר דרך הצלחת. זה גורם לגלים העוברים דרך הטבעת להיות כמחצית מאורך הגל מחוץ לפאזה עם אלה העוברים בצלחת. מכיוון שלגלים יש פסגות ושקתות, הם יכולים להוסיף יחד (אם בשלב ביחד) או לבטל זה את זה (אם מחוץ לשלב). כאשר אורכי הגל הם מחוץ לפאזה, שקתות גלים יבטלו את פסגות הגלים, מה שנקרא הפרעה הרסנית. מבנים השוברים אור נראים כהים על רקע בהיר של אור לא נשבר בלבד. באופן כללי יותר, מבנים השונים בתכונות כגון מקדם השבירה יהיו שונים ברמות החושך (איור$\PageIndex{5}$).

תרשים מציג את נתיב האור דרך מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. אור ממקור האור עובר לטבעת הטבעתית במעבה המייצרת חרוט אור הממוקד בדגימה. הדגימה שוברת או מחזירה אור. אור הנוסע ישירות מעדשת הקבל (אור לא מפוזר) ואור העובר דרך הדגימה (אור מפוזר) נמצאים מחוץ לשלב כאשר הם עוברים דרך לוחות המטרה והפאזה. אורכי גל בשלב או מחוץ לשלב מוסיפים יחד או מבטלים זה את זה. — איור$\PageIndex{5}$: דיאגרמה זו של מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ממחישה הבדלי פאזה בין האור העובר דרך האובייקט לרקע. הבדלים אלה מיוצרים על ידי העברת הקרניים דרך חלקים שונים של צלחת פאזה. קרני האור מונחות על גבי מישור התמונה, ומייצרות ניגודיות עקב התערבותן.

תרשים זה של מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ממחיש הבדלי פאזה בין האור העובר דרך האובייקט לרקע. הבדלים אלה מיוצרים על ידי העברת הקרניים דרך חלקים שונים של צלחת פאזה. קרני האור מונחות על גבי מישור התמונה, ומייצרות ניגודיות עקב התערבותן.

מכיוון שהוא מגביר את הניגודיות מבלי לדרוש כתמים, מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה משמשת לעתים קרובות לצפייה בדגימות חיות. מבנים מסוימים, כגון אברונים בתאים אוקריוטיים ואנדוספורים בתאים פרוקריוטים, מוצגים היטב עם מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (איור). $\PageIndex{6}$

מוצגים שני מיקרוגרפים של תא על רקע כהה. בתמונת שדה הבהיר התא הוא עיגול קלוש ובמרכזו עיגול אפור קטן. בתמונת ניגודיות פאזה התא הוא מעגל בהיר עם עיגול בהיר במרכז. — איור$\PageIndex{6}$: איור זה משווה תמונת שדה בהיר (משמאל) עם תמונת ניגודיות פאזה (מימין) של אותם תאי אפיתל קשקשיים פשוטים לא מוכתמים. התאים נמצאים במרכז ובפינה הימנית התחתונה של כל תצלום (הפריט הלא סדיר מעל התאים הוא פסולת תאית). שימו לב שהתאים הלא מוכתמים בתמונת השדה הבהיר כמעט בלתי נראים על הרקע, בעוד שהתאים בתמונת ניגודיות הפאזה נראים זוהרים על הרקע, וחושפים הרבה יותר פרטים.

איור זה משווה תמונת שדה בהיר (משמאל) עם תמונת ניגודיות פאזה (מימין) של אותם תאי אפיתל קשקשיים פשוטים לא מוכתמים. התאים נמצאים במרכז ובפינה הימנית התחתונה של כל תצלום (הפריט הלא סדיר מעל התאים הוא פסולת תאית). שימו לב שהתאים הלא מוכתמים בתמונת השדה הבהיר כמעט בלתי נראים על הרקע, בעוד שהתאים בתמונת ניגודיות הפאזה נראים זוהרים על הרקע, וחושפים הרבה יותר פרטים. (אשראי: "ברור קפיר" /ויקימדיה Commons)

מיקרוסקופי ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות

מיקרוסקופים של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) (הידועים גם בשם אופטיקה של נומרסקי) דומים למיקרוסקופים של ניגודיות פאזה בכך שהם משתמשים בדפוסי הפרעה כדי לשפר את הניגודיות בין תכונות שונות של דגימה. במיקרוסקופ DIC נוצרות שתי קרני אור בהן כיוון תנועת הגלים (קיטוב) שונה. ברגע שהקורות עוברות דרך הדגימה או בחלל נטול הדגימות, הן משולבות מחדש והשפעות הדגימות גורמות להבדלים בדפוסי ההפרעה הנוצרים משילוב הקורות. התוצאה היא תמונות בניגודיות גבוהה של אורגניזמים חיים בעלי מראה תלת מימדי. מיקרוסקופים אלה שימושיים במיוחד בהבחנה בין מבנים בתוך דגימות חיות ולא מוכתמות. (איור$\PageIndex{7}$).

מיקרוגרף מציג שרשרת מלבנים בעלי קצוות עבים. השרשראות מסתעפות ויש להן אשכולות של כדורים בקצוות. התמונה כולה היא וריאציות של אפור אך ניתן להבחין בהבדל העומק בין התאים מלפנים ומאחור זה לזה. — איור$\PageIndex{7}$: תמונת DIC של *Fonsecaea pedrosoi* שגדלה על אגר ליאוניאן שונה. פטרייה זו גורמת לכרומובלסטומיקוזיס, דלקת עור כרונית הנפוצה באקלים טרופי וסובטרופי.

תמונת DIC של Fonsecaea pedrosoi שגדלה על אגר לאוניאן שונה. פטרייה זו גורמת לכרומובלסטומיקוזיס, דלקת עור כרונית הנפוצה באקלים טרופי וסובטרופי.

תרגיל $\PageIndex{2}$

מהם כמה יתרונות של ניגודיות פאזה ומיקרוסקופיה DIC?

מיקרוסקופים פלואורסצנטיים

מיקרוסקופ פלואורסצנטי משתמש בכרומופורים פלואורסצנטיים הנקראים פלואורוכרומים, המסוגלים לספוג אנרגיה ממקור אור ואז לפלוט אנרגיה זו כאור גלוי. פלואורוכרומים כוללים חומרים פלואורסצנטיים באופן טבעי (כגון כלורופילים) וכן כתמי ניאון שמתווספים לדגימה ליצירת ניגודיות. צבעים כמו טקסס אדום ו- FITC הם דוגמאות לפלואורוכרומים. דוגמאות נוספות כוללות את צבעי חומצת הגרעין 4',6'-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ותפוז אקרידין.

המיקרוסקופ מעביר אור עירור, בדרך כלל צורה של EMR עם אורך גל קצר, כגון אור אולטרה סגול או כחול, לעבר הדגימה; הכרומופורים סופגים את אור העירור ופולטים אור גלוי באורכי גל ארוכים יותר. לאחר מכן מסננים את אור העירור (בין השאר מכיוון שאור אולטרה סגול מזיק לעיניים) כך שרק אור גלוי עובר דרך עדשת העין. זה מייצר תמונה של הדגימה בצבעים בהירים על רקע כהה.

מיקרוסקופים פלואורסצנטיים שימושיים במיוחד במיקרוביולוגיה קלינית. ניתן להשתמש בהם כדי לזהות פתוגנים, למצוא מינים מסוימים בתוך סביבה, או כדי למצוא את המיקומים של מולקולות ומבנים מסוימים בתוך תא. כמו כן פותחו גישות להבחין בין חיים לתאים מתים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהתבסס על האם הם תופסים פלואורוכרומים מסוימים. לפעמים משתמשים במספר פלואורוכרומים על אותה דגימה כדי להציג מבנים או תכונות שונות.

אחד היישומים החשובים ביותר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא טכניקה הנקראת immunofluorescence, המשמשת לזיהוי חיידקים מסוימים הגורמים למחלות על ידי התבוננות אם נוגדנים נקשרים אליהם. (נוגדנים הם מולקולות חלבון המיוצרות על ידי מערכת החיסון המתחברות לפתוגנים ספציפיים כדי להרוג או לעכב אותם.) ישנן שתי גישות לטכניקה זו: בדיקת אימונופלואורסצנטיות ישירה (DFA) ומבחן אימונופלואורסצנטי עקיף (IFA). ב- DFA, נוגדנים ספציפיים (למשל, אלה שמכוונים לנגיף הכלבת) מוכתמים בפלואורוכרום. אם הדגימה מכילה את הפתוגן הממוקד, ניתן לראות את הנוגדנים הנקשרים לפתוגן מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי. זה נקרא כתם נוגדנים ראשוני מכיוון שהנוגדנים המוכתמים מתחברים ישירות לפתוגן.

ב- IFA, נוגדנים משניים מוכתמים בפלואורוכרום ולא בנוגדנים ראשוניים. נוגדנים משניים אינם מתחברים ישירות לפתוגן, אך הם נקשרים לנוגדנים ראשוניים. כאשר הנוגדנים הראשוניים הבלתי מוכתמים נקשרים לפתוגן, ניתן לראות את הנוגדנים המשניים הפלואורסצנטיים נקשרים לנוגדנים הראשוניים. לפיכך, הנוגדנים המשניים מחוברים בעקיפין לפתוגן. מכיוון שנוגדנים משניים מרובים יכולים לעתים קרובות להיצמד לנוגדן ראשוני, IFA מגדיל את מספר הנוגדנים הפלואורסצנטיים המחוברים לדגימה, מה שמקל על הצגת התכונות בדגימה (איור$\PageIndex{8}$).

מיקרוגרף a מראה כדורים ירוקים פלואורסצנטיים על רקע שחור. מיקרוגרף b מציג צורות תולעת פלואורסצנטיות על רקע שחור. תרשים ג מתאר את התהליך של אימונופלואורסצנטי ישיר. באימונופלואורסצנציה ישירה פלואורוכרום מחובר לנוגדן ראשוני והנוגדן העיקרי מחובר לאנטיגן. באימונופלואורסצנטי עקיף הפלואורוכרום מחובר לנוגדן משני. הנוגדן המשני מחובר לנוגדן הראשוני; והנוגדן העיקרי מחובר לאנטיגן. — איור$\PageIndex{8}$: (א) כתם אימונופלואורסצנטי ישיר משמש להדמיית *Neisseria gonorrhoeae*, החיידק הגורם לזיבה. (ב) כתם אימונופלואורסצנטי עקיף משמש להדמיית זחלים של *Schistosoma mansoni*, תולעת טפילית הגורמת לסכיסטוזומיאזיס, מחלת מעיים הנפוצה באזורים הטרופיים. (ג) באימונופלואורסצנטי ישיר, הכתם נספג בנוגדן ראשוני, הנקשר לאנטיגן. באימונופלואורסצנטי עקיף, הכתם נספג על ידי נוגדן משני, הנקשר לנוגדן ראשוני, אשר בתורו נקשר לאנטיגן. (אשראי א: שינוי עבודות על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן; קרדיט ב: שינוי עבודות על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן)

תרגיל $\PageIndex{3}$

מדוע יש להשתמש בפלואורוכרומים כדי לבחון דגימה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי?

מיקרוסקופים קונפוקליים

בעוד שצורות אחרות של מיקרוסקופ אור יוצרות תמונה הממוקדת באופן מקסימלי במרחק יחיד מהמתבונן (העומק, או מישור z), מיקרוסקופ קונפוקלי משתמש בלייזר כדי לסרוק מספר מישורי z ברציפות. זה מייצר מספר רב של תמונות דו מימדיות ברזולוציה גבוהה בעומקים שונים, אותן ניתן לבנות לתמונה תלת מימדית על ידי מחשב. כמו במיקרוסקופים פלואורסצנטיים, כתמי ניאון משמשים בדרך כלל להגברת הניגודיות והרזולוציה. בהירות התמונה משופרת עוד יותר על ידי צמצם צר המבטל כל אור שאינו ממישור z. מיקרוסקופים קונפוקליים הם אפוא שימושיים מאוד לבחינת דגימות עבות כגון ביופילמים, אותם ניתן לבחון חיים ולא קבועים (איור). $\PageIndex{9}$

מיקרוגרף המציג כדורים סגולים (תאים) מקובצים בצרורות אפורים כהים (גליקנים בתפזורת). — איור$\PageIndex{9}$: ניתן להשתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להמחיש מבנים כגון ביופילם ציאנובקטריום השוכן על הגג. (קרדיט: שינוי עבודה על ידי האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה).

מיקרוסקופים דו-פוטונים

בעוד שהמיקרוסקופים הפלואורסצנטיים והקונפוקליים המקוריים אפשרו הדמיה טובה יותר של תכונות ייחודיות בדגימות, עדיין היו בעיות שמנעו הדמיה אופטימלית. הרגישות האפקטיבית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעת צפייה בדגימות עבות הוגבלה בדרך כלל על ידי התלקחות מחוץ למיקוד, מה שהביא לרזולוציה ירודה. מגבלה זו הופחתה במידה ניכרת במיקרוסקופ הקונפוקלי באמצעות חור סיכה קונפוקלי כדי לדחות פלואורסצנטיות רקע מחוץ למיקוד עם קטעים אופטיים דקים (<1 מיקרומטר) ולא מטושטשים. עם זאת, אפילו המיקרוסקופים הקונפוקליים חסרו את הרזולוציה הדרושה לצפייה בדגימות רקמות עבות. בעיות אלה נפתרו עם התפתחות המיקרוסקופ הדו-פוטוני, המשתמש בטכניקת סריקה, פלואורוכרומים ואור באורך גל ארוך (כגון אינפרא אדום) כדי להמחיש דגימות. האנרגיה הנמוכה הקשורה לאור באורך הגל הארוך פירושה ששני פוטונים חייבים לפגוע במיקום בו זמנית כדי לרגש את הפלואורוכרום. האנרגיה הנמוכה של אור העירור מזיקה פחות לתאים, ואורך הגל הארוך של אור העירור חודר ביתר קלות עמוק לדגימות עבות. זה הופך את המיקרוסקופ הדו-פוטוני לשימושי לבדיקת תאים חיים בתוך רקמות שלמות - פרוסות מוח, עוברים, איברים שלמים ואפילו בעלי חיים שלמים.

נכון לעכשיו, השימוש במיקרוסקופים של שני פוטונים מוגבל למעבדות קליניות ומחקריות מתקדמות בגלל העלויות הגבוהות של המכשירים. מיקרוסקופ יחיד של שני פוטונים עולה בדרך כלל בין 300,000$ ל 500,000$, והלייזרים המשמשים לרגש את הצבעים המשמשים בדגימות הם גם יקרים מאוד. עם זאת, ככל שהטכנולוגיה משתפרת, מיקרוסקופים של שני פוטונים עשויים להיות זמינים יותר במסגרות קליניות.

תרגיל $\PageIndex{4}$

אילו סוגי דגימות נבדקים בצורה הטובה ביותר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או דו-פוטונית?

מיקרוסקופ אלקטרונים

הרזולוציה התיאורטית המקסימלית של תמונות שנוצרו על ידי מיקרוסקופי אור מוגבלת בסופו של דבר על ידי אורכי הגל של האור הנראה. רוב מיקרוסקופי האור יכולים להגדיל רק 1000, ומעטים יכולים להגדיל עד 1500, אבל זה לא מתחיל להתקרב לכוח ההגדלה של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), המשתמש בקרני אלקטרונים באורך גל קצר ולא באור כדי להגדיל את ההגדלה והרזולוציה.

אלקטרונים, כמו קרינה אלקטרומגנטית, יכולים להתנהג כגלים, אך באורכי גל של 0.005 ננומטר, הם יכולים לייצר רזולוציה טובה בהרבה מאור גלוי. EM יכול לייצר תמונה חדה המוגדלת עד 100,000. לפיכך, EMs יכולים לפתור מבנים תת-תאיים כמו גם כמה מבנים מולקולריים (למשל, גדילים בודדים של DNA); עם זאת, לא ניתן להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים על חומר חי בגלל השיטות הדרושות להכנת הדגימות.

ישנם שני סוגים בסיסיים של EM: מיקרוסקופ אלקטרונים השידור (TEM) ומיקרוסקופ האלקטרונים הסורק (SEM) (איור$\PageIndex{10}$). ה- TEM מקביל במקצת למיקרוסקופ האור הבהיר מבחינת אופן פעולתו. עם זאת, הוא משתמש בקרן אלקטרונים מלמעלה מהדגימה הממוקדת באמצעות עדשה מגנטית (ולא עדשת זכוכית) ומוקרנת דרך הדגימה על גבי גלאי. אלקטרונים עוברים דרך הדגימה, ואז הגלאי לוכד את התמונה (איור$\PageIndex{11}$).

תצלום A מציג מיקרוסקופ אלקטרונים שידור: מכונה בצורת צינור גדול המחוברת לשולחן ליד מחשב. תצלום ב 'מציג מיקרוסקופ אלקטרונים סורק: מכונה עם הקרנות רבות היושבות על שולחן ליד מחשב. — איור$\PageIndex{10}$: (א) מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM). (ב) מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). (קרדיט א: שינוי עבודה על ידי "דשי" /ויקימדיה; קרדיט ב: שינוי עבודה על ידי "מיקרוסקופ ZEISS" /פליקר)

מוצגות דיאגרמות המשוות TEM ומיקרוסקופי אור. במיקרוסקופ האור האור ממקור האור ממוקד על ידי הקבל אל הדגימה. לאחר מכן האור ממוקד עוד יותר על ידי העדשה האובייקטיבית ועדשת העין ומגיע לבסוף לצופה. ב-TEM, אקדח אלקטרונים משחרר אלקטרונים דרך צינור. אלקטרונים אלה מתמקדים בדגימה על ידי אלקטרומגנטים בקצה הצינור. קרן האלקטרונים מגיעה לאחר מכן לעדשה האובייקטיבית ולבסוף לצופה. — איור$\PageIndex{11}$: מיקרוסקופים אלקטרונים משתמשים במגנטים כדי למקד קרני אלקטרונים בדומה לאופן שבו מיקרוסקופי אור משתמשים בעדשות כדי למקד את האור.

כדי שאלקטרונים יעברו דרך הדגימה ב-TEM, הדגימה חייבת להיות דקה במיוחד (עובי 20-100 ננומטר). התמונה מופקת בגלל אטימות משתנה בחלקים שונים של הדגימה. אטימות זו יכולה להיות משופרת על ידי צביעת הדגימה עם חומרים כגון מתכות כבדות, אשר צפופים אלקטרונים. TEM דורש שהקרן והדגימה יהיו בוואקום ושהדגימה תהיה דקה ומיובשת מאוד. השלבים הספציפיים הדרושים להכנת דגימה לתצפית תחת EM נדונים בפירוט בסעיף הבא.

SEMs יוצרים תמונות של משטחים של דגימות, בדרך כלל מאלקטרונים שנדפקים מדגימות על ידי קרן אלקטרונים. זה יכול ליצור תמונות מפורטות מאוד עם מראה תלת מימדי המוצגים על צג (איור$\PageIndex{12}$). בדרך כלל, דגימות מיובשות ומוכנות עם מקבעים המפחיתים חפצים, כגון הצטמקות, שניתן לייצר על ידי ייבוש, לפני שהם מצופים בשכבה דקה של מתכת כמו זהב. בעוד שמיקרוסקופ אלקטרונים שידור דורש קטעים דקים מאוד ומאפשר לראות מבנים פנימיים כגון אברונים ופנים הממברנות, ניתן להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי להציג את המשטחים של עצמים גדולים יותר (כגון גרגר אבקה) כמו גם את המשטחים של דגימות קטנות מאוד (איור$\PageIndex{13}$). חלק מה- EMs יכולים להגדיל תמונה עד 2,000,000. ¹

דיאגרמת TEM מציגה חוט מתח גבוה המחובר לאקדח אלקטרונים המשחרר קרן אלקטרונים. קרן האלקטרונים עוברת ליד עדשת הקבל הראשונה (מחוברת לצמצם הקבל), ואז עדשת הקבל השנייה (מחוברת גם לצמצם מעבה), ולאחר מכן דרך הדגימה על מחזיק הדגימה ומנעול האוויר (המחובר גם לעדשה אובייקטיבית וצמצם). לבסוף, קרן האלקטרונים עוברת למסך הפלואורסצנטי ולמצלמה. ה- SEM מתחיל באקדח אלקטרונים שיורה קרני אלקטרונים דרך אנודה, דרך עדשת מעבה, דרך סלילי סריקה והלאה לדגימה שעל הבמה. גלאי אלקטרונים backscatter מזהה אלקטרונים שנוסעים ישירות חזרה מהדגימה; גלאי אלקטרונים משניים מזהים אלקטרונים שנוסעים לצדדים. — איור$\PageIndex{12}$: איורים סכמטיים אלה משווים את המרכיבים של מיקרוסקופי אלקטרונים שידור ומיקרוסקופים אלקטרונים סורקים.

איור א מציג מיקרוגרף TEM עם רקע ברור ותא כהה במרכז. קו כפול מתאר את קצה התא וקורי חומר בתוך התא נראים לעין. איור b מציג מיקרוגרף SEM בעל אשכולות סגולים גדולים על רקע ירוק עם חורים קטנים. שלושת הממדיות של האשכולות הסגולים ניכרת. — איור$\PageIndex{13}$: (א) תמונת TEM זו של תאים בביופילם מציגה מבנים פנימיים מוגדרים היטב של התאים בגלל רמות שונות של אטימות בדגימה. (ב) תמונת SEM משופרת בצבע זה של החיידק *Staphylococcus aureus* ממחישה את היכולת של סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים כדי להציג תמונות תלת מימדיות של מבנה פני השטח של התאים. (קרדיט א: שינוי עבודות על ידי האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה; קרדיט ב: שינוי עבודות על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן)

תרגיל $\PageIndex{5}$

מהם כמה יתרונות וחסרונות של מיקרוסקופ אלקטרונים, בניגוד למיקרוסקופ אור, לבדיקת דגימות מיקרוביולוגיות?
אילו סוגים של דגימות נבדקים בצורה הטובה ביותר באמצעות TEM? סם?

שימוש במיקרוסקופיה לחקר ביופילמים

ביופילם הוא קהילה מורכבת של מין מיקרואורגניזם אחד או יותר, הנוצרת בדרך כלל כציפוי דקיק המחובר למשטח בגלל ייצור של חומר חוץ-פולימרי (EPS) הנצמד למשטח או בממשק בין משטחים (למשל, בין אוויר ומים). בטבע, ביופילמים נמצאים בשפע ולעתים קרובות תופסים נישות מורכבות בתוך מערכות אקולוגיות (איור). $\PageIndex{14}$ ברפואה, ביופילמים יכולים לצפות מכשירים רפואיים ולהתקיים בגוף. מכיוון שיש להם מאפיינים ייחודיים, כגון עמידות מוגברת נגד המערכת החיסונית ולתרופות אנטי-מיקרוביאליות, ביופילמים מעניינים במיוחד את המיקרוביולוגים והרופאים כאחד.

מכיוון שביופילמים עבים, לא ניתן לצפות בהם היטב באמצעות מיקרוסקופ אור; חיתוך ביופילם ליצירת דגימה דקה יותר עלול להרוג או להפריע לקהילה המיקרוביאלית. מיקרוסקופיה קונפוקלית מספקת תמונות ברורות יותר של ביופילמים מכיוון שהיא יכולה להתמקד במישור z אחד בכל פעם ולייצר תמונה תלת מימדית של דגימה עבה. צבעי פלורסנט יכולים להועיל בזיהוי תאים בתוך המטריצה. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקות כגון אימונופלואורסצנטיות והכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH), שבהן משתמשים בבדיקות פלואורסצנטיות לקשירה ל-DNA.

ניתן להשתמש במיקרוסקופ אלקטרוני לצפייה בביופילמים, אך רק לאחר התייבשות הדגימה, המייצרת חפצים לא רצויים ומעוותת את הדגימה. בנוסף לגישות אלה, ניתן לעקוב אחר זרמי מים דרך הצורות (כגון קונוסים ופטריות) של ביופילמים, באמצעות וידאו של התנועה של חרוזים מצופים פלואורסצנטי (איור). $\PageIndex{15}$

השלבים של ביופילם מוצגים. בשלב 1 (התקשרות ראשונית), כמה תאים מסומנים מתחברים למשטח. בשלב 2 (התקשרות בלתי הפיכה) גושים של תאים נמצאים על פני השטח. בשלב 3 (התבגרות) הגושים גדלו. בשלב 4 (התבגרות 2) הגושים התמזגו והתרחבו מאוד. בשלב 5 (פיזור) הגוש הגדול משחרר תאים מסומנים הרחק מפני השטח. שלבים אלה מוצגים גם במיקרוגרפים: 1) נקודות קטנות, 2) גושים גדולים יותר, 3) גוש גדול יותר, 4) מסה גדולה, 5) מסה גדולה עם פתח בחלק העליון. — איור$\PageIndex{14}$: ביופילם נוצר כאשר חיידק פלנקטוני (צף חופשי) ממין אחד או יותר נדבקים למשטח, מייצרים רפש ויוצרים מושבה. (קרדיט: הספרייה הציבורית למדע).

מוצג מיקרוגרף עם רקע שחור המכיל מלבנים בהירים רבים בגושים. — איור$\PageIndex{15}$: בתמונה זו, מינים מרובים של חיידקים גדלים בביופילם על נירוסטה (מוכתם ב- DAPI עבור miscroscopy אפיפלואורסצנטי). (קרדיט: ריקרדו מורגה, רודני דונלן).

מיקרוסקופ בדיקת סריקה

מיקרוסקופ בדיקה סורק אינו משתמש באור או באלקטרונים, אלא בבדיקות חדות מאוד המועברות על פני הדגימה ומתקשרות איתה ישירות. זה מייצר מידע שניתן להרכיב לתמונות עם הגדלות של עד 100,000,000. ניתן להשתמש בהגדלות כה גדולות כדי לצפות באטומים בודדים על משטחים. עד כה, טכניקות אלה שימשו בעיקר למחקר ולא לאבחון.

ישנם שני סוגים של מיקרוסקופ בדיקה סריקה: מיקרוסקופ המנהור הסורק (STM) ומיקרוסקופ הכוח האטומי (AFM). STM משתמש בבדיקה המועברת ממש מעל הדגימה שכן הטיית מתח קבועה יוצרת פוטנציאל לזרם חשמלי בין הגשושית לדגימה. זרם זה מתרחש באמצעות מנהור קוונטי של אלקטרונים בין החללית לדגימה, ועוצמת הזרם תלויה במרחק בין הגשושית לדגימה. החללית מועברת אופקית מעל פני השטח ועוצמת הזרם נמדדת. מיקרוסקופ מנהור סריקה יכול למפות ביעילות את המבנה של משטחים ברזולוציה שבה אטומים בודדים ניתן לזהות.

בדומה ל- STM, ל- AFMs יש בדיקה דקה המועברת ממש מעל הדגימה. עם זאת, במקום למדוד וריאציות בזרם בגובה קבוע מעל הדגימה, AFM קובע זרם קבוע ומודד שינויים בגובה קצה הבדיקה כשהוא עובר מעל הדגימה. כאשר קצה הבדיקה מועבר מעל הדגימה, כוחות בין האטומים (כוחות ואן דר ואלס, כוחות נימים, קשר כימי, כוחות אלקטרוסטטיים ואחרים) גורמים לו לנוע למעלה ולמטה. סטיה של קצה הבדיקה נקבעת ונמדדת באמצעות חוק האלסטיות של הוק, ומידע זה משמש לבניית תמונות של פני הדגימה ברזולוציה ברמה האטומית (איור$\PageIndex{16}$).

מיקרוגרף a מציג מעגל המסודר בשורות חוזרות. מיקרוגרף ב 'מציג גדילים ארוכים בערימה. — איור$\PageIndex{16}$: sTMs ו- AFMs מאפשרים לנו להציג תמונות ברמה האטומית. (א) תמונת STM זו של משטח זהב טהור מציגה אטומי זהב בודדים המסודרים בעמודים. (ב) תמונת AFM זו מציגה מולקולות ארוכות דמויי גדילים של ננוצלולוזה, חומר שנוצר במעבדה המופק מסיבי צמחים. (קרדיט א: שינוי העבודה על ידי "ארווינרוסן" /ויקימדיה Commons).

תרגיל $\PageIndex{6}$

למי יש הגדלה גבוהה יותר, מיקרוסקופ אור או מיקרוסקופ בדיקה סורק?
ציין יתרון אחד ומגבלה אחת של מיקרוסקופ בדיקה סריקה.

טבלה של סוגי מיקרוסקופ אור. אלה משתמשים באור גלוי או אולטרה סגול כדי לייצר תמונה. הגדלה: עד פי 1000 בערך. מיקרוסקופים של ברייטפילד משמשים בדרך כלל במגוון רחב של יישומי מעבדה כמיקרוסקופ הסטנדרטי ומייצרים תמונה על רקע בהיר. תמונת המדגם של Bacillus sp. מראה מוטות אדומים על רקע ברור; נקודות ירוקות קטנות בתאים האדומים מצביעות על אנדוספורים. מיקרוסקופים של Darkfield מגבירים את הניגודיות מבלי להכתים על ידי הפקת תמונה בהירה על רקע כהה. אלה שימושיים במיוחד לצפייה בדגימות חיות. תמונת המדגם (Borrelia burgdorferi) מראה ספירלות בהירות על רקע כהה. מיקרוסקופים של ניגודיות פאזה משתמשים בשבירה והפרעות הנגרמות על ידי מבנים בדגימה כדי ליצור תמונות בעלות ניגודיות גבוהה ברזולוציה גבוהה ללא כתמים, מה שהופך אותה לשימושית לצפייה בדגימות ומבנים חיים כגון אנדוספורים ואברונים. תמונת המדגם (Pseudomonas sp.) מציגה מוטות כהים עם הילה בהירה. ניגודיות הפרעות דיפרנציאלית (DIC) משתמשת בדפוסי הפרעות כדי לשפר את הניגודיות בין מאפיינים שונים של דגימה כדי לייצר תמונות בניגודיות גבוהה של אורגניזמים חיים בעלי מראה תלת מימדי, מה שהופך אותה לשימושית במיוחד בהבחנה בין מבנים בתוך דגימות חיות ולא מוכתמות. תמונות שנצפו חושפות מבנים מפורטים בתוך תאים. תמונת המדגם (אי קולי 0157: H7) מציגה אליפסות תלת מימדיות קטנות. פלואורסצנטיות משתמשת בכתמי ניאון כדי לייצר תמונה. ניתן להשתמש במיקרוסקופים פלואורסצנטיים לזיהוי פתוגנים, למציאת מינים מסוימים, להבדיל בין חיים למתים או למציאת מיקום של מולקולות מסוימות בתוך תא; משמש גם לאימונופלואורסצנטי. תמונת המדגם (Pseuodomonas putida מוכתמת בצבעי ניאון כדי לדמיין כמוסה) מראה מוט ירוק על רקע שחור. מיקרוסקופים קונפוקליים משתמשים בלייזר כדי לסרוק מספר מישורי z ברציפות, ומייצרים תמונות דו-ממדיות רבות ברזולוציה גבוהה בעומקים שונים שניתן לבנות לתמונה תלת מימדית על ידי מחשב, מה שהופך את זה שימושי לבחינת דגימות עבות כגון ביופילמים. תמונת המדגם (תאי מעי עכבר מוכתמים בצבע פלואורסצנטי) מציגה תאים בצבעים שונים על רקע כהה. — איור$\PageIndex{17}$: (קרדיט "ברייטפילד": שינוי עבודה על ידי האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה; קרדיט "Darkfield": שינוי עבודה על ידי האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה; קרדיט "ניגודיות פאזה": שינוי עבודה על ידי האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה; אשראי "DIC": שינוי עבודה על ידי האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה; קרדיט "פלואורסצנטי": שינוי עבודה על ידי החברה האמריקאית למיקרוביולוגיה; אשראי "קונפוקל": שינוי עבודה של החברה האמריקאית למיקרוביולוגיה; דו קרדיט "קונפוקל": שינוי עבודה של החברה האמריקאית למיקרוביולוגיה; דו אשראי פוטון": שינוי של עבודה על ידי אלברטו דיאספרו, פאולו ביאנצ'יני, ג'וזפה ויסידומיני, מריו פארטה, פאולה רמואינו, צ'זארה אוסאי).

טבלה של מיקרוסקופים אלקטרונים המשתמשים בקורות אלקטרונים הממוקדות במגנטים כדי לייצר תמונה. הגדלה: 20—100,000 איקס או יותר. מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM) משתמשים באמצעי אלקטרונים העוברים דרך דגימה לתמונות קטנות ויזואליות; שימושי לתצפית על דגימות קטנות ודקות כגון קטעי רקמות ומבנים תת-תאיים. תמונת המדגם (נגיף האבולה) מציגה צינור המעוצב לאות d בקצה אחד. מיקרוסקופי אלקטרונים סורקים (SEM) משתמשים בקורות אלקטרונים כדי להמחיש משטחים; שימושי לצפייה בפרטי השטח התלת מימדיים של דגימות. תמונת המדגם (קמפילובקטור ג'ג'וני) מציגה ספירלות תלת מימדיות עבות. — איור$\PageIndex{18}$: (קרדיט "TEM": שינוי עבודה על ידי האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה; קרדיט "SEM": שינוי עבודה על ידי האגודה האמריקאית למיקרוביולוגיה)

טבלה של מיקרוסקופי בדיקה סורקים עם בדיקות חדות מאוד המועברות על פני הדגימה ומתקשרות איתה ישירות. הגדלה: 100—100,000,000,000 x או יותר. מיקרוסקופ מנהור סורק (STM) משתמש בבדיקה המועברת אופקית במרחק קבוע ממש מעל הדגימה בזמן שעוצמת הזרם נמדדת; יכול למפות את מבנה המשטחים ברמה האטומית; עובד בצורה הטובה ביותר על חומרים מוליכים אך יכול לשמש גם לבדיקת חומרים אורגניים כגון DNA אם הם קבועים על משטח. תמונת המדגם (של משטח זהב) מציגה עיגולים קטנים בשורות חוזרות. מיקרוסקופים של כוח אטומי (AFM) משמשים בכמה דרכים, כולל שימוש בלייזר הממוקד על שלוחה למדידת כיפוף הקצה או בדיקה שהועברה מעל הדגימה בזמן שהגובה צריך לשמור על זרם קבוע נמדד; שימושי לצפייה בדגימות ברמה האטומית וניתן להשתמש בהן ביתר קלות עם דגימות שאינן מוליכות. תמונת המדגם (nanocellulse carboxymethylated נספג על משטח סיליקה) מראה גדילים ארוכים לאורך כל הדרך. — איור$\PageIndex{19}$: טכניקות מיקרוסקופיה לסריקת מיקרוסקופים של בדיקה.

מושגי מפתח וסיכום

סוגים רבים של מיקרוסקופים משתמשים בטכנולוגיות שונות ליצירת מיקרוגרפים. רובם שימושיים עבור סוג מסוים של דגימה או יישום.
מיקרוסקופ אור משתמש בעדשות כדי למקד אור בדגימה כדי לייצר תמונה. מיקרוסקופי אור נפוצים כוללים שדה בהיר, שדה כהה, ניגודיות פאזה, ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות, פלואורסצנטיות, מיקרוסקופים קונפוקליים ושני פוטונים.
מיקרוסקופ אלקטרונים ממקד אלקטרונים בדגימה באמצעות מגנטים, ומייצר הגדלה גדולה בהרבה ממיקרוסקופ אור. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הן שתי צורות נפוצות.
מיקרוסקופ בדיקה סריקה מייצר תמונות בהגדלה גדולה עוד יותר על ידי מדידת משוב מבדיקות חדות המקיימות אינטראקציה עם הדגימה. מיקרוסקופי בדיקה כוללים את מיקרוסקופ המנהור הסורק (STM) ואת מיקרוסקופ הכוח האטומי (AFM).

הערות שוליים

1 "מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים JEM-ARM200F", JEOL ארה"ב בע"מ, www.Jeolusa.com/מוצרים/טראן... מפרטים. גישה 28/8/2015.

רשימת מילים

מיקרוסקופ כוח אטומי: מיקרוסקופ בדיקה סורק המשתמש בבדיקה דקה המועברת ממש מעל הדגימה כדי למדוד כוחות בין האטומים לגשושית

המשקפת: בעל שתי עיניות

מיקרוסקופ ברייטפילד: מיקרוסקופ אור מורכב עם שתי עדשות; הוא מייצר תמונה כהה על רקע בהיר

כפתור מיקוד גס: כפתור במיקרוסקופ המייצר תנועות גדולות יחסית להתאמת המיקוד

כרומופורים: פיגמנטים הסופגים ומשקפים אורכי גל מסוימים של אור (נותנים להם צבע)

עדשת קונדנסר: עדשה במיקרוסקופ הממקדת אור ממקור האור אל הדגימה

מיקרוסקופ קונפוקלי: מיקרוסקופ לייזר סורק המשתמש בצבעי ניאון ולייזרי עירור ליצירת תמונות תלת מימדיות
מיקרוסקופ שדה כהה: מיקרוסקופ אור מורכב המייצר תמונה בהירה על רקע כהה; בדרך כלל מיקרוסקופ שדה בהיר שונה

דיאפרגמה: רכיב של מיקרוסקופ; בדרך כלל מורכב מדיסק מתחת לבמה עם חורים בגדלים שונים; ניתן לכוונן כדי לאפשר פחות או יותר אור ממקור האור להגיע לדגימה

מיקרוסקופ הפרעה-ניגודיות דיפרנציאלי: מיקרוסקופ המשתמש באור מקוטב להגברת הניגודיות

מיקרוסקופ אלקטרונים: סוג של מיקרוסקופ המשתמש בקרני אלקטרונים באורך גל קצר ולא באור כדי להגדיל את ההגדלה והרזולוציה

כפתור מיקוד עדין: כפתור במיקרוסקופ המייצר תנועות קטנות יחסית להתאמת המיקוד

מיקרוסקופ פלואורסצנטי: מיקרוסקופ המשתמש בפלואורוכרומים טבעיים או בכתמי ניאון כדי להגביר את הניגודיות

פלואורוכרומים: כרומופורים המאירים (סופגים ואז פולטים אור)

מאיר: מקור האור במיקרוסקופ

אימונופלואורסצנטי: טכניקה המשתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי ובפלואורוכרומים ספציפיים לנוגדנים כדי לקבוע את נוכחותם של פתוגנים ספציפיים בדגימה

מונוקולרי: בעל עינית אחת

עדשות אובייקטיביות: במיקרוסקופ אור, העדשות הקרובות ביותר לדגימה, ממוקמות בדרך כלל בקצות הצריחים

עדשה עינית: במיקרוסקופ, העדשה הקרובה ביותר לעין (נקראת גם עינית)
עדשת טבילה בשמן: עדשה אובייקטיבית מיוחדת במיקרוסקופ המיועדת לשימוש עם שמן טבילה לשיפור הרזולוציה
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה: מיקרוסקופ אור המשתמש בעצירה טבעתית ובצלחת טבעתית להגברת הניגודיות
ריאוסטט: מתג דימר השולט בעוצמת המאיר במיקרוסקופ אור
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM): סוג של מיקרוסקופ אלקטרונים שמקפיץ אלקטרונים מהדגימה ויוצר תמונה של פני השטח
מיקרוסקופ בדיקה סריקה: מיקרוסקופ המשתמש בבדיקה העוברת על פני הדגימה במרחק קבוע ואילו הזרם, הרגיש לגודל הפער, נמדד
מיקרוסקופ מנהור סריקה: מיקרוסקופ המשתמש בבדיקה המועברת ממש מעל הדגימה כהטיית מתח קבועה יוצרת פוטנציאל לזרם חשמלי בין הגשושית לדגימה
שלב: הפלטפורמה של מיקרוסקופ שעליו מונחות שקופיות
הגדלה כוללת: במיקרוסקופ אור הוא ערך המחושב על ידי הכפלת ההגדלה של העין בהגדלה של העדשות האובייקטיביות
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM): סוג של מיקרוסקופ אלקטרונים המשתמש בקרן אלקטרונים, ממוקדת במגנטים, העוברת דרך דגימה דקה
מיקרוסקופ שני פוטונים: מיקרוסקופ המשתמש באורך גל ארוך או באור אינפרא אדום כדי להאיר פלואורוכרומים בדגימה
ידיות במה מכניות x-y: ידיות במיקרוסקופ המשמשות להתאמת מיקום הדגימה על פני הבמה, בדרך כלל כדי למרכז אותה ישירות מעל האור