Skip to main content
Global

17.3: רצף גנום שלם

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    205942

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    מיומנויות לפיתוח

    • תאר שלושה סוגים של רצף
    • הגדר רצף גנום שלם

    למרות שחלו התקדמות משמעותית במדעי הרפואה בשנים האחרונות, הרופאים עדיין מבולבלים מכמה מחלות, והם משתמשים ברצף גנום שלם כדי לרדת לעומק הבעיה. רצף גנום שלם הוא תהליך הקובע את רצף ה- DNA של גנום שלם. רצף גנום שלם הוא גישה בכוח גס לפתרון בעיות כאשר יש בסיס גנטי בליבה של מחלה. מספר מעבדות מספקות כעת שירותים לרצף, ניתוח ופרשנות של גנומים שלמים.

    לדוגמה, רצף אקסום שלם הוא חלופה בעלות נמוכה יותר לרצף גנום שלם. ברצף אקסומים, רק האזורים המקודדים ומייצרים אקסון של ה- DNA הם ברצף. בשנת 2010 נעשה שימוש ברצף שלם של אקסומים כדי להציל ילד צעיר שבמעיים שלו היו מורסות מסתוריות מרובות. לילד היו מספר ניתוחים במעי הגס ללא הקלה. לבסוף, בוצע רצף אקסום שלם, שחשף פגם במסלול השולט באפופטוזיס (מוות תאי מתוכנת). השתלת מח עצם שימשה להתגברות על הפרעה גנטית זו, מה שהוביל לריפוי לילד. הוא היה האדם הראשון שטופל בהצלחה על סמך אבחנה שנעשתה על ידי רצף אקסום שלם. כיום, רצף הגנום האנושי זמין יותר וניתן להשלים אותו תוך יום או יומיים תמורת כ -1000 דולר.

    אסטרטגיות המשמשות בפרויקטי רצף

    טכניקת הרצף הבסיסית המשמשת בכל פרויקטי הרצף המודרניים היא שיטת סיום השרשרת (הידועה גם כשיטת דידאוקסי), שפותחה על ידי פרד סנגר בשנות השבעים. שיטת סיום השרשרת כוללת שכפול DNA של תבנית חד-גדילית עם שימוש בפריימר ודאוקסינוקלאוטיד רגיל (dNTP), שהוא מונומר, או יחידה אחת, של DNA. הפריימר וה-dNTP מעורבבים עם חלק קטן של דידאוקסינוקלאוטידים המסומנים באופן פלואורסצנטי (ddNTPs). ה-ddNTPs הם מונומרים שחסרים להם קבוצת הידרוקסיל (—OH) באתר שבו נוקלאוטיד אחר מתחבר בדרך כלל ליצירת שרשרת (איור). \(\PageIndex{1}\)

    דאוקסינוקלאוטיד מורכב מסוכר דאוקסיריבוז, בסיס ושלוש קבוצות פוספט. Dideoxyribose זהה לדאוקסיריבוז פרט לכך שקבוצת ההידרוקסיל (-OH) במיקום 3 'מוחלפת ב H. A 3' הידרוקסיל נחוץ להארכת שרשרת ה-DNA, ולכן השרשרת מפסיקה לצמוח אם דידאוקסיריבוז במקום דאוקסיריבוז משולב בשרשרת הגדלה.
    איור\(\PageIndex{1}\): דידאוקסינוקלאוטיד דומה במבנהו לדאוקסינוקלאוטיד, אך חסר לו קבוצת ההידרוקסיל 3' (מסומנת בתיבה). כאשר משולב דידאוקסינוקלאוטיד בגדיל DNA, סינתזת ה- DNA נעצרת.

    כל ddNTP מסומן בצבע שונה של פלואורופור. בכל פעם ש-ddNTP משולב בגדיל המשלים הגדל, הוא מסיים את תהליך שכפול ה-DNA, מה שמביא למספר גדילים קצרים של DNA משוכפל שכל אחד מהם מסתיים בנקודה אחרת במהלך השכפול. כאשר תערובת התגובה מעובדת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל לאחר הפרדה לגדילים בודדים, גדילי ה-DNA המרובים ששוכפלו לאחרונה יוצרים סולם בגלל הגדלים השונים. מכיוון ש- ddNTPs מסומנים באופן פלואורסצנטי, כל רצועה בג'ל משקפת את גודל גדיל ה- DNA ואת ה- ddNTP שהפסיק את התגובה. הצבעים השונים של ddNTP המסומנים בפלואורופור עוזרים לזהות את ddNTP המשולב במיקום זה. קריאת הג'ל על בסיס הצבע של כל רצועה בסולם מייצרת את רצף גדיל התבנית (איור\(\PageIndex{2}\)).

    החלק השמאלי של איור זה מציג גדיל אב של DNA עם הרצף GATTCAGC, וארבעה גדילי בת, שכל אחד מהם נוצר בנוכחות דידאוקסינוקלאוטיד אחר: dDATP, ddCTP, ddGTP או ddTTP. השרשרת הגדלה מסתיימת כאשר משולב ddNTP, וכתוצאה מכך גדילי בת באורכים שונים. החלק הימני של תמונה זו מראה את ההפרדה של שברי ה- DNA על בסיס גודל. כל ddNTP מסומן באופן פלואורסצנטי בצבע שונה כך שניתן לקרוא את הרצף לפי גודל כל שבר וצבעו.
    איור\(\PageIndex{2}\): שיטת סיום שרשרת הדידאוקסי של פרדריק סנגר מומחשת. באמצעות dideoxynucleotides, ניתן לסיים את שבר ה- DNA בנקודות שונות. ה- DNA מופרד על בסיס גודל, וניתן לקרוא להקות אלה, בהתבסס על גודל השברים.

    אסטרטגיות מוקדמות: רצף רובה ציד ורצף סוף זוגי

    בשיטת רצף רובה ציד, מספר עותקים של שבר DNA נחתכים באופן אקראי לחתיכות קטנות רבות יותר (קצת כמו מה שקורה למחסנית זריקה עגולה כאשר יורים מרובה ציד). לאחר מכן כל המקטעים עוברים רצף בשיטת רצף השרשרת. לאחר מכן, בעזרת מחשב, השברים מנותחים כדי לראות היכן הרצפים שלהם חופפים. על ידי התאמת רצפים חופפים בסוף כל שבר, ניתן לשנות את כל רצף ה- DNA. רצף גדול יותר המורכב מרצפים קצרים חופפים נקרא contig. כאנלוגיה, קחו בחשבון שלמישהו יש ארבעה עותקים של תצלום נוף שמעולם לא ראיתם קודם לכן ואינו יודע דבר על איך הוא אמור להופיע. לאחר מכן האדם קורע כל תצלום בידיו, כך שיהיו חלקים בגודל שונה מכל עותק. לאחר מכן האדם מערבב את כל החלקים יחד ומבקש ממך לשחזר את התצלום. באחד החלקים הקטנים יותר אתה רואה הר. ביצירה גדולה יותר אתה רואה שאותו הר נמצא מאחורי אגם. שבר שלישי מציג רק את האגם, אך הוא מגלה שיש בקתה על שפת האגם. לכן, מהתבוננות במידע החופף בשלושת השברים הללו, אתה יודע שהתמונה מכילה הר מאחורי אגם שיש בו בקתה על חופו. זהו העיקרון מאחורי שחזור רצפי DNA שלמים באמצעות רצף רובה ציד.

    במקור, רצף רובה ציד ניתח רק קצה אחד של כל שבר עבור חפיפות. זה הספיק לרצף גנומים קטנים. עם זאת, הרצון לרצף גנומים גדולים יותר, כמו זה של אדם, הוביל לפיתוח רצף רובה ציד כפול חבית, הידוע יותר רשמית בשם רצף סוף זוגי. ברצף קצה זוגי, שני הקצוות של כל שבר מנותחים לחפיפה. רצף סוף זוגי הוא, אם כן, מסורבל יותר מרצף רובה ציד, אך קל יותר לשחזר את הרצף מכיוון שיש מידע זמין יותר.

    רצף הדור הבא

    מאז 2005, טכניקות רצף אוטומטיות המשמשות מעבדות נמצאות תחת המטריה של רצף הדור הבא, שהיא קבוצה של טכניקות אוטומטיות המשמשות לרצף DNA מהיר. רצפים אוטומטיים אלה בעלות נמוכה יכולים ליצור רצפים של מאות אלפי או מיליוני שברים קצרים (25 עד 500 זוגות בסיס) בטווח של יום אחד. רצפים אלה משתמשים בתוכנה מתוחכמת כדי לעבור את התהליך המסורבל של סדר בכל השברים.

    חיבור אבולוציה: השוואת רצפים

    יישור רצף הוא סידור של חלבונים, DNA או RNA; הוא משמש לזיהוי אזורי דמיון בין סוגי תאים או מינים, מה שעשוי להצביע על שימור תפקוד או מבנים. ניתן להשתמש ביישורי רצף לבניית עצים פילוגנטיים. האתר הבא משתמש בתוכנה בשם BLAST (כלי חיפוש יישור מקומי בסיסי).

    תחת "פיצוץ בסיסי", לחץ על "פיצוץ נוקלאוטיד". הזן את הרצף הבא בתיבה הגדולה "רצף שאילתות": ATTGTCGATTGCA. מתחת לתיבה, אתר את השדה "מינים" והקלד "אנושי" או "Homo sapiens". לאחר מכן לחץ על "BLAST" כדי להשוות את הרצף שהוזן מול רצפים ידועים של הגנום האנושי. התוצאה היא שרצף זה מתרחש בלמעלה ממאה מקומות בגנום האנושי. גלול מטה מתחת לגרפיקה עם הסורגים האופקיים ותראה תיאור קצר של כל אחד מהלהיטים התואמים. בחר אחד הלהיטים ליד החלק העליון של הרשימה ולחץ על "גרפיקה". זה יביא אותך לדף שמראה היכן נמצא הרצף בתוך הגנום האנושי כולו. אתה יכול להזיז את המחוון שנראה כמו דגל ירוק קדימה ואחורה כדי להציג את הרצפים מיד סביב הגן שנבחר. לאחר מכן תוכל לחזור לרצף שבחרת על ידי לחיצה על כפתור "ATG".

    שימוש ברצפי גנום שלם של אורגניזמים מודלים

    הגנום הראשון שרצף לחלוטין היה של נגיף חיידקי, ה- bacteriophage fx174 (5368 זוגות בסיס); זה הושג על ידי פרד סנגר באמצעות רצף רובה ציד. מאוחר יותר רצפו מספר גנומים אברון וויראליים אחרים. האורגניזם הראשון שהגנום שלו היה רצף היה החיידק Haemophilus influenzae; זה הושג על ידי קרייג ונטר בשנות השמונים. כ -74 מעבדות שונות שיתפו פעולה ברצף הגנום של השמרים Saccharomyces cerevisiae, שהחל בשנת 1989 והושלם בשנת 1996, מכיוון שהוא היה גדול פי 60 מכל גנום אחר שרצף. עד 1997, רצפי הגנום של שני אורגניזמים מודלים חשובים היו זמינים: החיידק Escherichia coli K12 והשמרים Saccharomyces cerevisiae. גנומים של אורגניזמים מודלים אחרים, כגון העכבר Mus musculus, זבוב הפירות תסיסנית מלנוגסטר, הנמטודה Caenorhabditis elegans ובני אדם Homo sapiens ידועים כיום. הרבה מחקר בסיסי מבוצע במודלים של אורגניזמים מכיוון שניתן ליישם את המידע על אורגניזמים דומים גנטית. אורגניזם מודל הוא מין הנחקר כמודל להבנת התהליכים הביולוגיים במינים אחרים המיוצגים על ידי אורגניזם המודל. רצף גנומים שלמים מסייע במאמצי המחקר באורגניזמים מודליים אלה. תהליך הצמדת המידע הביולוגי לרצפי גנים נקרא ביאור גנום. ביאור של רצפי גנים מסייע בניסויים בסיסיים בביולוגיה מולקולרית, כגון עיצוב פריימרים PCR ומטרות RNA.

    קישור ללמידה

    DNA_sequence.png

    לחץ על כל שלב באתר רצף הגנום של HHMI.

    שימושים ברצפי גנום

    מיקרו מערכי DNA הם שיטות המשמשות לזיהוי ביטוי גנים על ידי ניתוח מערך של שברי DNA המקובעים לשקופית זכוכית או לשבב סיליקון לזיהוי גנים פעילים וזיהוי רצפים. ניתן לגלות כמעט מיליון הפרעות גנוטיפיות באמצעות מיקרו מערכים, בעוד שרצף גנום שלם יכול לספק מידע על כל ששת מיליארד זוגות הבסיס בגנום האנושי. למרות שמחקר היישומים הרפואיים של רצף הגנום מעניין, דיסציפלינה זו נוטה להתעכב על תפקוד גנים לא תקין. הכרת הגנום כולו תאפשר גילוי מוקדם של מחלות עתידיות והפרעות גנטיות אחרות, מה שיאפשר לקבל החלטות מושכלות יותר לגבי אורח חיים, תרופות והולדת ילדים. הגנומיקה עדיין בחיתוליה, אם כי יום אחד זה עשוי להפוך לשגרה להשתמש ברצף גנום שלם כדי לסנן כל יילוד כדי לזהות חריגות גנטיות.

    בנוסף למחלות ולרפואה, גנומיקה יכולה לתרום לפיתוח אנזימים חדשים הממירים ביומסה לדלק ביולוגי, מה שמביא לייצור יבול ודלק גבוה יותר, ועלות נמוכה יותר לצרכן. ידע זה אמור לאפשר שיטות שליטה טובות יותר על החיידקים המשמשים לייצור דלקים ביולוגיים. גנומיקה יכולה גם לשפר את השיטות המשמשות לניטור ההשפעה של מזהמים על מערכות אקולוגיות ולעזור לנקות מזהמים סביבתיים. הגנומיקה אפשרה פיתוח של אגרוכימיה ותרופות שיכולות להועיל למדע הרפואה ולחקלאות.

    זה נשמע נהדר שיש לנו את כל הידע שאנחנו יכולים לקבל מרצף גנום שלם; עם זאת, לבני אדם יש אחריות להשתמש בידע זה בחוכמה. אחרת, זה יכול להיות קל לנצל לרעה את כוחו של ידע כזה, מה שמוביל לאפליה המבוססת על גנטיקה של אדם, הנדסה גנטית אנושית ודאגות אתיות אחרות. מידע זה יכול להוביל גם לסוגיות משפטיות הנוגעות לבריאות ופרטיות.

    סיכום

    רצף גנום שלם הוא המשאב העדכני ביותר הזמין לטיפול במחלות גנטיות. חלק מהרופאים משתמשים ברצף גנום שלם כדי להציל חיים. לגנומיקה יש יישומים תעשייתיים רבים, כולל פיתוח דלק ביולוגי, חקלאות, תרופות ובקרת זיהום. העיקרון הבסיסי של כל אסטרטגיות הרצף המודרניות כרוך בשיטת סיום השרשרת של רצף.

    למרות שרצפי הגנום האנושי מספקים תובנות מרכזיות לאנשי מקצוע בתחום הרפואה, החוקרים משתמשים ברצפי גנום שלם של אורגניזמים מודלים כדי להבין טוב יותר את הגנום של המין. אוטומציה והעלות המופחתת של רצף גנום שלם עשויים להוביל לרפואה מותאמת אישית בעתיד.

    רשימת מילים

    שיטת סיום שרשרת
    שיטה של רצף DNA באמצעות dideoxynucleotides שכותרתו לסיים שכפול DNA; זה נקרא גם שיטת dideoxy או שיטת סנגר
    קונטיג
    רצף גדול יותר של DNA המורכב מרצפים קצרים חופפים
    דאוקסינוקלאוטיד
    מונומר בודד (יחידה אחת) של DNA
    דידאוקסינוקלאוטיד
    מונומר בודד של DNA שחסר לו קבוצת הידרוקסיל (—OH)
    מיקרו-מערך DNA
    שיטה המשמשת לזיהוי ביטוי גנים על ידי ניתוח מערך של שברי DNA המקובעים לשקופית זכוכית או לשבב סיליקון לזיהוי גנים פעילים וזיהוי רצפים
    ביאור הגנום
    תהליך הצמדת מידע ביולוגי לרצפי גנים
    אורגניזם מודל
    מינים הנחקרים ומשמשים כמודל להבנת התהליכים הביולוגיים במינים אחרים המיוצגים על ידי אורגניזם המודל
    רצף הדור הבא
    קבוצה של טכניקות אוטומטיות המשמשות לרצף DNA מהיר
    רצף רובה ציד
    שיטה המשמשת לרצף שברי DNA מרובים ליצירת רצף של פיסת DNA גדולה
    רצף גנום שלם
    תהליך הקובע את רצף ה- DNA של גנום שלם