20.5: Mbinu za antibody Auto-Fluores

Malengo ya kujifunza

• Eleza faida za majaribio ya antibody ya immunofluorescent kwa kulinganisha na vipimo visivyo vya fluores
• Linganisha majaribio ya antibody ya moja kwa moja na ya moja kwa moja ya
• Eleza jinsi cytometer ya mtiririko inaweza kutumika kupima subsets maalum ya seli zilizopo katika mchanganyiko tata wa aina za seli
• Eleza jinsi sorter ya seli iliyoanzishwa na fluorescence inaweza kutumika kutenganisha aina za kipekee za seli

Mtazamo wa haraka wa bakteria kutoka sampuli ya kliniki kama vile usufi wa koo au sputum inaweza kupatikana kwa njia ya mbinu za antibody za umeme (FA) ambazo zinaunganisha alama ya umeme (fluorogen) kwenye eneo la mara kwa mara la antibody, na kusababisha molekuli ya mwandishi ambayo ni ya haraka kutumia, rahisi kuona au kupima, na uwezo wa kumfunga kwa alama lengo na maalum ya juu. Tunaweza pia studio seli, kuruhusu sisi usahihi kupima subsets fulani ya seli au hata kusafisha subsets hizi kwa ajili ya utafiti zaidi.

Kama ilivyo kwa vipimo vya enzyme, mbinu za FA zinaweza kuwa moja kwa moja, ambazo kinachoitwa MaB hufunga antigen, au isiyo ya moja kwa moja, ambayo antibodies ya sekondari ya polyclonal hufunga antibodies ya mgonjwa ambayo huguswa na antigen iliyoandaliwa. Matumizi ya mbinu hizi mbili zilionyeshwa kwenye Mchoro 2.3.8. Mbinu FA pia kutumika katika automatiska kiini kuhesabu na kuchagua mifumo ya enumerate au kutenganisha subpopulations labeled ya seli katika sampuli.

Mbinu za antibody za umeme za moja

Moja kwa moja fluorescent antibody (DFA) vipimo kutumia fluorescently labeled MAB kumfunga na kuangaza lengo antigen. Uchunguzi wa DFA ni muhimu hasa kwa uchunguzi wa haraka wa magonjwa ya bakteria. Kwa mfano, antibodies inayoitwa fluorescence dhidi ya Streptococcus pyogenes (kundi A strep) inaweza kutumika kupata uchunguzi wa strep koo kutoka swab ya koo. Uchunguzi ni tayari katika suala la dakika, na mgonjwa anaweza kuanza kwenye antibiotics kabla hata kuondoka kliniki. Mbinu za DFA pia zinaweza kutumika kutambua pneumonia inayosababishwa na Mycoplasma pneumoniae au Legionella pneumophila kutoka sampuli za sputum (Kielelezo\(\PageIndex{1}\)). Antibodies ya fluorescent hufunga kwa bakteria kwenye slide ya darubini, kuruhusu kugundua tayari kwa bakteria kwa kutumia microscope ya fluorescence. Hivyo, mbinu ya DFA ni muhimu kwa kutazama bakteria fulani ambazo ni vigumu kutenganisha au utamaduni kutoka kwa sampuli za mgonjwa.

Kielelezo\(\PageIndex{1}\): Kielelezo cha kijani cha umeme MaB dhidi ya L. pneumophila hutumiwa hapa kutazama na kutambua bakteria kutoka kwa smear ya sampuli kutoka kwa njia ya kupumua ya mgonjwa wa pneumonia. (mikopo: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani la Microbiolojia)

Zoezi\(\PageIndex{1}\)

Katika mtihani wa antibody wa moja kwa moja wa fluorescent, antibody ya fluorescent ina

Moja kwa moja ya umeme antibody Mbinu

Vipimo vya antibody vya umeme vya moja kwa moja (IFA\(\PageIndex{2}\)) (Kielelezo) hutumiwa kutafuta antibodies katika serum ya mgonjwa. Kwa mfano, mtihani wa IFA wa utambuzi wa kaswende hutumia seli za T. pallidum zilizotengwa na mnyama wa maabara (bakteria haziwezi kupandwa kwenye vyombo vya habari vya maabara) na smear iliyoandaliwa kwenye slide ya kioo. Seramu ya mgonjwa huenea juu ya antibodies ya smear na kupambana na treponemal, ikiwa iko, inaruhusiwa kumfunga. Seramu inafishwa na antibody ya sekondari imeongezwa. Antibody ya sekondari ni immunoglobulin ya antihuman inayounganishwa na fluorogen. Juu ya uchunguzi, bakteria ya T. pallidum itaonekana tu ikiwa wamefungwa na antibodies kutoka serum ya mgonjwa.

Mtihani wa IFA kwa kaswisi hutoa mchango muhimu kwa mtihani wa VDRL uliojadiliwa katika Kuchunguza Complexes za Antigen-Antibody. VDRL ina uwezekano mkubwa wa kuzalisha athari za uongo kuliko mtihani wa IFA; hata hivyo, VDRL ni mtihani bora wa kuamua kama maambukizi sasa yanafanya kazi.

Uchunguzi wa IFA pia ni muhimu kwa ajili ya ugonjwa wa ugonjwa wa autoimmune. Kwa mfano, lupus erythematosus ya utaratibu (SLE) (tazama Matatizo ya Autoimmune) ina sifa ya viwango vya kujieleza vya antibodies za nyuklia (ANA). Hizi autoantibodies zinaweza kuonyeshwa dhidi ya aina mbalimbali za protini za DNA na hata dhidi ya DNA yenyewe. Kwa sababu autoimmunity mara nyingi ni vigumu kutambua, hasa mapema katika maendeleo ya ugonjwa, kupima kwa ANA inaweza kuwa kidokezo muhimu katika kufanya uchunguzi na kuanza matibabu sahihi.

IFA kwa ANA huanza kwa kurekebisha seli zilizopandwa katika utamaduni kwa slide ya kioo na kuwafanya waweze kupunguzwa kwa antibody. Slides ni kisha incubated na dilutions serial ya serum kutoka kwa mgonjwa. Baada ya kuingizwa, slide inafishwa ili kuondoa protini zisizofunguliwa, na antibody ya fluorescent (IgG ya antihuman iliyounganishwa na fluorogen) imeongezwa. Baada ya kuchanganya na kuosha, seli zinaweza kuchunguzwa kwa fluorescence inayoonekana karibu na kiini (Kielelezo\(\PageIndex{3}\)). Jina la ANA katika seramu linatambuliwa na dilution ya juu inayoonyesha fluorescence. Kwa sababu watu wengi wenye afya wanaelezea ANA, Chuo cha Marekani cha Rheumatology kinapendekeza kwamba titer lazima iwe angalau 1:40 mbele ya dalili zinazohusisha mifumo miwili au zaidi ya chombo kuchukuliwa kuwa dalili ya SLE. ¹

Kielelezo\(\PageIndex{2}\): (a) mtihani wa IFA hutumiwa kuchunguza antibodies maalum ya antijeni kwa kuwawezesha kumfunga kwa antigen iliyowekwa kwenye uso na kisha kuangaza complexes hizi na conjugate ya sekondari ya antibody-fluorogen. (b) Katika mfano huu wa micrograph ya mtihani wa antibody wa umeme wa moja kwa moja, antibodies ya mgonjwa kwa virusi vya surua hufunga kwa antijeni za virusi zilizopo kwenye seli zilizoambukizwa na dawa zilizoambukizwa zilizowekwa kwenye slide. Antibodies ya sekondari hufunga antibodies ya mgonjwa na kubeba molekuli (mikopo b: mabadiliko ya kazi na Shirika la Marekani kwa Microbiology)

Kielelezo\(\PageIndex{3}\): Katika mtihani huu kwa antibodies antinuclear (ANA), seli ni wazi kwa serum kutoka kwa mgonjwa watuhumiwa wa kufanya ANA na kisha kwa mAB fluorescent maalum kwa immunoglobulin binadamu. Kama udhibiti, seramu kutoka kwa mgonjwa mwenye afya pia hutumiwa. Fluorescence inayoonekana karibu na kiini inaonyesha uwepo wa ANA katika serum ya mgonjwa. Katika udhibiti wa afya ambapo viwango vya chini vya ANA vinazalishwa, kijani kali hugunduliwa. (mikopo kushoto, kulia: mabadiliko ya kazi na Al-Hussaini AA, Alzahrani MD, Alenizi AS, Suliman NM, Khan MA, Alharbi SA, Chentoufi AA)

Zoezi\(\PageIndex{2}\)

1. Katika mtihani wa antibody wa umeme wa moja kwa moja, antibody ya fluorescent inaunganisha nini?
2. Mtihani wa ANA unatafuta nini?

Mtiririko wa Cytometry

Fluorescently labeled antibodies inaweza kutumika kupima seli ya aina maalum katika mchanganyiko tata kwa kutumia mtiririko cytometry (Kielelezo\(\PageIndex{4}\)), automatiska, kiini kuhesabu mfumo kwamba hutambua seli fluorescing kama wao kupita katika nyembamba tube seli moja kwa wakati mmoja. Kwa mfano, katika maambukizi ya VVU, ni muhimu kujua kiwango cha seli za CD4 T katika damu ya mgonjwa; ikiwa idadi huanguka chini ya 500 kwa kila μL ya damu, mgonjwa huwa na uwezekano mkubwa wa kupata maambukizi yanayofaa; chini ya 200 kwa μL, mgonjwa hawezi tena kuunda majibu muhimu ya kinga ya kinga wakati wote. Uchambuzi huanza kwa incubating mchanganyiko seli idadi ya watu (kwa mfano, seli nyeupe za damu kutoka kwa wafadhili) na fluorescently labeled MaB maalum kwa subpopulation ya seli (kwa mfano, Anti-CD4). Majaribio mengine yanaangalia alama za seli mbili wakati huo huo kwa kuongeza fluorogen tofauti kwa mAB inayofaa. Seli hizo huletwa kwa cytometer ya mtiririko kupitia capillary nyembamba ambayo inasababisha seli kupitisha faili moja. Laser hutumiwa kuamsha fluorogen. Nuru ya fluorescent huangaza nje pande zote, hivyo detector ya fluorescence inaweza kuwekwa kwa pembe kutoka mwanga wa laser tukio.

Kielelezo\(\PageIndex{4}\) inaonyesha bar obscuration mbele ya detector mbele-kuwatawanya kwamba kuzuia laser mwanga kutoka kupiga detector. Kama kiini kinapita kupitia bar ya laser, detector ya kusambaza mbele hutambua mwanga uliotawanyika karibu na bar ya kuficha. Mwanga uliotawanyika hubadilishwa kuwa pigo la voltage, na cytometer inahesabu kiini. Fluorescence kutoka kiini kinachoitwa hugunduliwa na detectors ya kuwatawanya upande. Mwanga hupita kupitia vioo mbalimbali vya dichroic kama vile mwanga uliotolewa kutoka fluorophore unapokea na detector sahihi.

Kielelezo\(\PageIndex{4}\): Katika mtiririko wa cytometry, mchanganyiko wa seli za fluorescently zilizoitwa na unlabeled hupita kupitia capillary nyembamba. Laser inasisimua fluorogen, na kiwango cha fluorescence cha kila kiini kinapimwa na detector. (mikopo: mabadiliko ya kazi na “Kierano” /Wikimedia Commons)

Takwimu zinakusanywa kutoka kwa detectors mbele na upande wa kuwatawanya. Njia moja data hizi zinaweza kuwasilishwa ni kwa namna ya histogram. Kusambaza mbele kunawekwa kwenye y -axis (kuwakilisha idadi ya seli), na kusambaza upande huwekwa kwenye x -axis (kuwakilisha fluoresence ya kila kiini). Kuongezeka kwa x -axis ni logarithmic, hivyo kiwango cha fluorescence kinaongezeka kwa sababu ya 10 na kila kitengo kinaongezeka kando ya mhimili. Kielelezo\(\PageIndex{5}\) inaonyesha mfano ambao utamaduni wa seli ni pamoja na antibody masharti ya fluorophore kuchunguza seli CD8 na kisha kuchambuliwa na mtiririko cytometry. Histogram ina kilele mbili. Kilele upande wa kushoto kina masomo ya chini ya fluorescence, inayowakilisha subset ya idadi ya seli (takriban seli 30) ambazo hazizidi fluoresce; kwa hiyo, hawajafungwa na antibody na kwa hiyo hawaelezei CD8. Kilele upande wa kulia kina masomo ya juu ya fluorescence, inayowakilisha subset ya idadi ya seli (takriban seli 100) zinazoonyesha fluorescence; kwa hiyo, wao wamefungwa na antibody na kwa hiyo huelezea CD8.

Kielelezo\(\PageIndex{5}\): Data ya mtiririko wa cytometry mara nyingi huandaliwa kama histogram. Katika histogram, eneo chini ya kila kilele ni sawa na idadi ya seli katika kila idadi ya watu. X-axis ni fluorescence ya jamaa iliyoonyeshwa na seli (kwa kiwango cha logi), na y -axis inawakilisha idadi ya seli katika ngazi fulani ya fluorescence.

Zoezi\(\PageIndex{3}\)

1. Nini madhumuni ya laser katika cytometer mtiririko?
2. Katika pato kutoka kwa cytometer ya mtiririko, eneo chini ya histogram ni sawa na nini?

Mtazamo wa Hospitali

Baada ya kuwajulisha wagonjwa wote 1300, hospitali huanza ratiba ya uchunguzi wa VVU. Uteuzi ulipangwa chini ya wiki 3 baada ya ziara ya mwisho ya hospitali ya mgonjwa ili kupunguza hatari ya hasi za uongo. Kwa sababu baadhi ya chanya za uongo zilitarajiwa, daktari wa afya ya umma alianzisha itifaki ya ushauri kwa mgonjwa yeyote ambaye ELISA yake isiyo ya moja kwa moja ilirudi chanya.

Kati ya wagonjwa 1300, nane walijaribu chanya kwa kutumia ELISA. Tano kati ya vipimo hivi vilikuwa vimebatilishwa na vipimo visivyofaa vya magharibi vya magharibi, lakini kipigo kimoja cha magharibi kilirudi chanya, kuthibitisha kwamba mgonjwa huyo alikuwa ameambukizwa VVU mbili iliyobaki blots magharibi akarudi indeterminate. Watu hawa walipaswa kuwasilisha mtihani wa tatu, PCR, kuthibitisha kuwepo au kutokuwepo kwa utaratibu wa VVU. Kwa bahati nzuri, wagonjwa wote majaribio hasi.

Kwa upande wa mgonjwa mmoja alithibitisha kuwa na VVU, vipimo haviwezi kuthibitisha au kupinga uhusiano wowote na sindano zilizoathiriwa na mfanyakazi wa zamani wa hospitali. Hata hivyo, bima ya hospitali itafunika kikamilifu matibabu ya mgonjwa, ambayo ilianza mara moja.

Ingawa sasa tuna madawa ya kulevya ambayo kwa kawaida yanafaa katika kudhibiti maendeleo ya VVU na UKIMWI, bado hakuna tiba. Ikiwa imesalia bila kutibiwa, au ikiwa regimen ya madawa ya kulevya inashindwa, mgonjwa atapata kupungua kwa kasi kwa idadi ya seli za msaidizi wa CD4, na kusababisha uharibifu mkubwa wa kazi zote za kinga zinazofaa. Hata kupungua kwa wastani wa nambari za seli za msaidizi T kunaweza kusababisha ugonjwa wa immunodeficiency, na kuacha mgonjwa huathiriwa na maambukizi yanayofaa. Ili kufuatilia hali ya seli za msaidizi wa mgonjwa T, hospitali itatumia cytometry ya mtiririko. Mtihani huu nyeti inaruhusu madaktari kwa usahihi kuamua idadi ya seli msaidizi T ili waweze kurekebisha matibabu kama idadi iko chini ya seli 500/μL.

Kiini kuchagua Kutumia immunofluorescence

Cytometer mtiririko na immunofluorescence pia inaweza kubadilishwa ili kutatua seli kutoka sampuli moja katika subpopulations kujitakasa ya seli kwa madhumuni ya utafiti. Mabadiliko haya ya cytometer ya mtiririko huitwa fluorescence-activated kiini sorter (FACS). Katika FACS, fluorescence na kiini inasababisha kifaa kuweka malipo kwenye droplet ya maji ya kusafirisha yaliyo na seli hiyo. Malipo ni maalum kwa wavelength ya mwanga wa fluorescent, ambayo inaruhusu kuchagua tofauti na mashtaka hayo tofauti. Uchaguzi unafanywa na deflector ya umeme ambayo husababisha droplet iliyoshtakiwa iliyo na kiini kwenye chombo kimoja cha kukusanya au kingine. Mchakato huo husababisha subpopulations yenye kujitakasa sana ya seli.

Upeo mmoja wa FACS ni kwamba inafanya kazi tu kwenye seli pekee. Hivyo, njia ingekuwa kazi katika kuchagua seli nyeupe za damu, kwani zipo kama seli pekee. Lakini kwa seli katika tishu, mtiririko cytometry inaweza kutumika tu kama tunaweza ushuru wa tishu na kuitenganisha katika seli moja (kwa kutumia proteases kuunganisha molekuli kiini-kiini kujitoa) bila kuvuruga uadilifu wa seli. Njia hii inaweza kutumika kwenye tumors, lakini mara nyingi zaidi, immunohistochemistry na immunocytochemistry hutumiwa kujifunza seli katika tishu.

Unganisha na Kujifunza

Tazama video ili ujifunze zaidi kuhusu jinsi mtiririko wa cytometry na FACS hufanya kazi.

Zoezi\(\PageIndex{4}\)

Katika fluorescence ulioamilishwa kiini kuchagua, nini tabia ya seli lengo inaruhusu yao kuwa kutengwa?

Jedwali\(\PageIndex{1}\) linalinganisha utaratibu wa mbinu za antibody za fluorescent zilizojadiliwa katika sehemu hii

Jedwali\(\PageIndex{1}\): Mbinu za antibody za umeme

Aina ya Uchunguzi	Mfumo	Mifano
Antibody ya umeme ya moja kwa moja (DFA)	Inatumia fluorogen-antibody conjugates kwa studio bakteria kutoka sampuli za mgonjwa	Kuangalia Legionella pneumophila kutoka swab ya koo
Antibody ya umeme isiyo ya moja kwa moja (IFA)	Hutambua antibodies maalum ya ugonjwa katika serum ya patent	Kutambua kaswisi; kuchunguza antibodies za nyuklia (ANA) kwa lupus na magonjwa mengine ya kawaida
Mtiririko wa cytometry	Lebo utando wa seli na fluorogen-antibody conjugate alama msisimko na laser; mashine inahesabu kiini na kumbukumbu fluorescence jamaa	Kuhesabu idadi ya seli za CD4 au CD8 zilizoitwa fluorescently katika sampuli
Fluorescence ulioamilishwa kiini sorter (FACS)	Fomu ya mtiririko wa cytometry ambayo wote huhesabu seli na hutenganisha kimwili ndani ya mabwawa ya seli za juu na za chini za fluorescence	Uamuzi wa seli za kansa

Dhana muhimu na Muhtasari

• Vipimo vya immunofluorescence hutumia conjugates ya antibody-fluorogen ili kuangaza antigens kwa kutambua rahisi, haraka.
• Immunofluorescence moja kwa moja inaweza kutumika kuchunguza uwepo wa bakteria katika sampuli za kliniki kama vile sputum.
• Immunofluorescence isiyo ya moja kwa moja hutambua kuwepo kwa antibodies maalum ya antijeni katika sera ya mgonjwa. Antibody ya fluorescent hufunga kwa antibody maalum ya antigen badala ya antigen.
• Matumizi ya majaribio ya immunofluorescence ya moja kwa moja kuchunguza antibodies ya nyuklia ni chombo muhimu katika uchunguzi wa magonjwa kadhaa ya autoimmune.
• Mtiririko wa cytometry hutumia MABs za fluorescent dhidi ya protini za membrane za seli ili kupima subsets maalum za seli katika mchanganyiko tata.
• Fluorescence-ulioamilishwa kiini sorters ni ugani wa mtiririko cytometry ambayo fluorescence kiwango ni kutumika kimwili tofauti seli katika idadi ya juu na chini fluorescence.

maelezo ya chini

1. 1 Gill, James M., ANNA M. Quisel, PETER V. Rocca, na DENE T. Walters. “Utambuzi wa lupus erythematosus ya utaratibu.” Daktari wa familia ya Marekani 68, hakuna. 11 (2003): 2179-2186.