20.2: Kuchunguza Antigen-Antibody Complexes katika vitro

Malengo ya kujifunza

• Eleza aina mbalimbali za majaribio yaliyotumiwa kupata complexes ya antigen-antibody
• Eleza mazingira ambayo magumu ya antigen-antibody hutoka nje ya suluhisho
• Eleza jinsi antibodies katika serum ya mgonjwa inaweza kutumika kutambua magonjwa

Vipimo vya maabara kuchunguza kingamwili na antijeni nje ya mwili (kwa mfano, katika tube ya mtihani) huitwa katika vipimo vya vitro. Wakati antibodies zote mbili na antigens zao zinazofanana zipo katika suluhisho, tunaweza mara nyingi kuchunguza mmenyuko wa mvua ambayo complexes kubwa (lattices) huunda na kukaa nje ya suluhisho. Katika sehemu kadhaa zifuatazo, tutajadili majaribio kadhaa ya kawaida katika vitro.

Precipitin Athari

Tata inayoonekana ya antigen-antibody inaitwa precipitin, na katika vipimo vya vitro vinavyozalisha precipitin huitwa athari za precipitin. Mmenyuko wa precipitin kawaida huhusisha kuongeza antigens mumunyifu kwenye tube ya mtihani iliyo na suluhisho la antibodies. Kila antibody ina silaha mbili, ambayo kila mmoja anaweza kumfunga kwa epitope. Wakati antibody inafunga kwa antigens mbili, antigens mbili zimefungwa pamoja na antibody. Tani inaweza kuunda kama antibodies kumfunga antigens zaidi na zaidi pamoja, na kusababisha precipitin (Kielelezo\(\PageIndex{1}\)). Vipimo vingi vya precipitin hutumia antiseramu ya polikloni badala ya kingamwili za monoclonal kwa sababu kingamwili za polikloni zinaweza kumfunga kwa epitopi nyingi, na kufanya malezi ya kimiani uwezekano mkubwa zaidi. Ingawa MABs inaweza kumfunga antigens fulani, kisheria kitatokea mara nyingi, na kuifanya uwezekano mdogo kwamba precipitin inayoonekana itaunda.

Kielelezo\(\PageIndex{1}\): Polyclonal antiserum hufunga kwa epitopes nyingi kwenye antigen, na kusababisha malezi ya kimiani ambayo husababisha precipitin inayoonekana. Antibodies ya monoclonal inaweza tu kumfunga kwa epitope moja; kwa hiyo, chini ya kisheria hutokea na malezi ya bandia kwa ujumla haitoke.

Kiasi cha mvua pia inategemea mambo mengine kadhaa. Kwa mfano, mvua huimarishwa wakati antibodies zina mshikamano mkubwa kwa antigen. Wakati antibodies nyingi hufunga antigen na mshikamano wa juu, hata kisheria ya juu-mshikamano hutumia vifungo visivyo na noncovalent, ili mwingiliano wa mtu binafsi mara nyingi utavunja na mwingiliano mpya utatokea.

Kwa kuongeza, kwa malezi ya precipitin kuonekana, kuna lazima iwe na uwiano bora wa antibody kwa antigen. Uwiano bora hauwezekani kuwa uwiano wa 1:1 antigen-to-antibody; inaweza kutofautiana kwa kasi, kulingana na idadi ya epitopes kwenye antigen na darasa la antibody. Baadhi ya antijeni wanaweza kuwa na epitopi moja au mbili tu kutambuliwa na antiserum, ambapo antijeni nyingine zinaweza kuwa na epitopes mbalimbali na/au matukio mbalimbali ya epitope sawa kwenye molekuli moja ya antigen.

Kielelezo\(\PageIndex{2}\) kinaonyesha jinsi uwiano wa antigen na antibody huathiri kiasi cha mvua. Ili kufikia uwiano bora, antigen inaongezwa polepole kwenye suluhisho iliyo na antibodies, na kiasi cha precipitin kinatambuliwa kwa usawa. Awali, hakuna antigen ya kutosha ili kuzalisha malezi ya bandia inayoonekana; hii inaitwa eneo la ziada ya antibody. Kama antigen zaidi inaongezwa, mmenyuko huingia eneo la ulinganifu (au eneo la ulinganifu), ambapo mwingiliano bora wa antigen-antibody na mvua ya juu hutokea. Ikiwa hata antigen zaidi iliongezwa, kiasi cha antigen ingekuwa nyingi na kwa kweli kusababisha kiasi cha mvua kupungua.

Kielelezo\(\PageIndex{2}\): Kama antigen inaongezwa polepole kwenye suluhisho iliyo na antibody ya kiasi cha mara kwa mara, kiasi cha precipitin huongezeka kama uwiano wa antibody-to-antigen unakaribia eneo la ulinganifu na hupungua mara moja uwiano wa antigen unazidi uwiano bora.

Zoezi\(\PageIndex{1}\)

1. Precipitin ni nini?
2. Kwa nini antisera ya polyclonal huzalisha mmenyuko bora wa precipitin?

Precipitin pete mtihani

Mbinu mbalimbali zinatuwezesha kutumia malezi ya precipitin kupima ama ukolezi wa antigen au kiasi cha antibody iliyopo katika antiserum. Mbinu moja ni mtihani wa pete ya precipitin (Kielelezo\(\PageIndex{3}\)), ambayo hutumiwa kuamua kiasi cha jamaa cha antibody maalum ya antijeni katika sampuli ya serum. Ili kufanya mtihani huu, seti ya zilizopo za mtihani huandaliwa kwa kuongeza suluhisho la antigen chini ya kila tube. Kila tube inapata kiasi sawa cha suluhisho, na mkusanyiko wa antigens ni mara kwa mara (kwa mfano, 1 mg/ml). Kisha, glycerol imeongezwa kwenye suluhisho la antigen katika kila tube ya mtihani, ikifuatiwa na dilution ya serial ya antiserum. Glycerol inazuia kuchanganya antiserum na suluhisho la antigen, kuruhusu kisheria ya antigen-antibody kufanyika tu kwenye interface ya ufumbuzi mbili. Matokeo yake ni pete inayoonekana ya precipitin katika zilizopo zilizo na uwiano wa antigen-antibody ndani ya eneo la ulinganifu. Dilution hii ya juu na pete inayoonekana hutumiwa kuamua titer ya antibodies. Jina ni usawa wa dilution ya juu inayoonyesha matokeo mazuri, yaliyotolewa kama namba nzima. Katika Kielelezo\(\PageIndex{3}\), titer ni 16.

Wakati kipimo cha titer haituambii kwa maneno kamili kiasi gani antibody iko sasa, hutoa kipimo cha shughuli za kibiolojia, ambayo mara nyingi ni muhimu zaidi kuliko kiasi kamili. Katika mfano huu, itakuwa si muhimu kujua nini wingi wa IgG walikuwa sasa katika antiserum, kwa sababu kuna specifikationer mbalimbali ya antibody sasa; lakini ni muhimu kwa sisi kujua ni kiasi gani cha shughuli antibody katika serum ya mgonjwa ni moja kwa moja dhidi ya antigen ya riba (kwa mfano, pathogen fulani au allergen).

Kielelezo\(\PageIndex{3}\): Mtihani wa pete ya precipitin unafanywa kwa kutumia suluhisho la kawaida la antigen chini ya tube na dilution ya serial ya antiserum juu ya tube. Glycerol inazuia ufumbuzi mbili kutoka kuchanganya ili mvua hutokea tu kwenye interface. Pete inayoonekana ya mvua inaonekana katika dilutions 1/4, 1/8, na 1/16, kuonyesha kwamba viwango hivi ni ndani ya eneo la ulinganifu. Tangu 1/16 ni dilution ya juu ambayo precipitin inazingatiwa, titer ni ya kawaida, au 16.

Ouchterlony mtihani

Wakati precipitin pete mtihani hutoa ufahamu katika mwingiliano antibody-antigen, pia ina baadhi ya vikwazo. Inahitaji matumizi ya kiasi kikubwa cha seramu, na uangalifu mkubwa lazima uchukuliwe ili kuepuka kuchanganya ufumbuzi na kuharibu pete. Kufanya mtihani sawa katika tumbo la agar gel inaweza kupunguza matatizo haya. Aina hii ya upimaji ni tofauti inayoitwa immunodiffusion mara mbili au mtihani wa Ouchterlony kwa Orjan Ouchterlony, ¹ ambaye kwanza alielezea mbinu hiyo mwaka 1948.

Wakati agar inakaswa sana, inazalisha gel wazi, isiyo rangi. Mashimo hupigwa kwenye gel ili kuunda visima, na antigen na antisera huongezwa kwenye visima vya jirani. Protini zinaweza kuenea kwa njia ya gel, na arcs ya precipitin huunda kati ya visima katika eneo la ulinganifu. Kwa sababu safu ya precipitin ni kubwa mno kueneza kupitia gel, arcs ni imara imefungwa mahali na rahisi kuona (Kielelezo\(\PageIndex{4}\)).

Ingawa sasa kuna mbinu nyeti zaidi na za kiasi cha kuchunguza mwingiliano wa antibody-antigen, mtihani wa Ouchterlony hutoa njia ya haraka na ya ubora wa kuamua kama antiserum ina antibodies dhidi ya antigen fulani. Mtihani wa Ouchterlony ni muhimu hasa wakati unatafuta reactivity ya msalaba. Tunaweza kuangalia antiserum dhidi ya kundi la antigens karibu kuhusiana na kuona ni mchanganyiko gani fomu precipitin arcs.

Kielelezo\(\PageIndex{4}\): Mtihani wa Ouchterlony huweka antigen (vizuri A) na antisera (visima 1 hadi 5) katika gel. Antibodies na antigen huenea kupitia gel, na kusababisha arc precipitin kuunda katika eneo la ulinganifu. Katika mfano huu, antiserum tu katika vizuri 1 ina antibodies kwa antigen. Arc precipitin kusababisha ni imara kwa sababu tani ni kubwa mno kueneza kupitia gel. (mikopo kushoto: mabadiliko ya kazi na Higgins PJ, Tong C, Borenfreund E, Okin RS, Bendich A)

Uchunguzi wa immunodiffusion

Uchunguzi wa immunodiffusion wa radial (RID) unafanana na uchunguzi wa Ouchterlony lakini hutumiwa kupima kwa usahihi ukolezi wa antijeni badala ya kulinganisha antijeni tofauti. Katika mtihani huu, antiserum huongezwa kwa agar yenye hasira (agar ya kioevu saa kidogo juu ya 45° C), ambayo hutiwa kwenye sahani ndogo ya petri au kwenye slide ya kioo na kuruhusiwa kupendeza. Wells hukatwa kwenye agar kilichopozwa, na antigen huongezwa kwenye visima na kuruhusiwa kueneza. Kama antigen na antibody huingiliana, huunda eneo la mvua. Mraba wa kipenyo cha ukanda wa mvua ni sawa sawa na mkusanyiko wa antigen. Kwa kupima maeneo ya mvua zinazozalishwa na sampuli za mkusanyiko unaojulikana (angalia pete ya nje ya sampuli kwenye Kielelezo\(\PageIndex{5}\)), tunaweza kuandaa safu ya kawaida ya kuamua mkusanyiko wa suluhisho isiyojulikana. Uchunguzi wa RID ni mtihani muhimu pia kwa kuamua mkusanyiko wa protini nyingi za serum kama vile protini za C3 na C4 zinazosaidia, kati ya wengine.

Kielelezo\(\PageIndex{5}\): Katika uchunguzi huu wa immunodiffusion radial (RID), antiserum huchanganywa na agar kabla ya kupozwa, na ufumbuzi ulio na antijeni huongezwa kwa kila vizuri katika viwango vya kuongezeka (visima 1-4). Suluhisho la antigen la mkusanyiko usiojulikana linaongezwa vizuri 5. Kanda za mvua hupimwa na kupangwa dhidi ya pembe ya kawaida ili kuamua ukolezi wa antigen wa sampuli isiyojulikana. (miduara ya mikopo: mabadiliko ya kazi na Kangwa M, Yelemane V, Polat AN, Gorrepati KD, Grasselli M, Fernández-Lahore M)

Zoezi\(\PageIndex{2}\)

1. Kwa nini precipitin pete fomu katika precipitin pete mtihani, na ni nini baadhi ya sababu kwa nini pete inaweza kuunda?
2. Kulinganisha na kulinganisha mbinu kutumika katika mtihani Ouchterlony na radial immunodiffusion assay.

Uchunguzi wa floculation

Uchunguzi wa flocculation unafanana na mmenyuko wa precipitini isipokuwa kwamba unahusisha antijeni zisizo na mumunyifu kama vile lipids. Flocculant ni sawa na precipitini kwa kuwa kuna kimiani inayoonekana ya antigen na antibody, lakini kwa sababu lipidi hazipatikani katika suluhisho la maji, haziwezi kuharakisha. Badala ya mvua, flocculation (kunyoosha) huzingatiwa katika maji ya tube ya mtihani.

Kutumia Flocculation kwa mtihani kwa Kaswisi

Kaswende ni maambukizi ya ngono ambayo yanaweza kusababisha ugonjwa mkali, sugu kwa watu wazima. Aidha, hupitishwa kwa urahisi kutoka kwa mama walioambukizwa kwa watoto wao wachanga wakati wa ujauzito na kujifungua, mara nyingi husababisha kuzaliwa au matatizo makubwa ya afya ya muda mrefu kwa watoto wachanga. Kwa bahati mbaya, kaswisi pia inaweza kuwa vigumu kutambua kwa mama wanaotarajia, kwa sababu mara nyingi haipatikani, hasa kwa wanawake. Aidha, wakala wa causative, bakteria Treponema pallidum, ni vigumu kukua kwenye vyombo vya habari vya kawaida vya maabara na ndogo mno kuona kutumia microcopy ya kawaida. Kwa sababu hizi, uchunguzi wa kudhani wa kaswisi kwa ujumla huthibitishwa moja kwa moja katika maabara kwa kutumia vipimo vinavyotambua kingamwili kwa antigens za treponemal.

Mwaka 1906, mwanasayansi wa Ujerumani August von Wassermann (1866—1925) alianzisha mtihani wa kwanza kwa kaswende uliotegemea kuchunguza kingamwili za kupambana na treponemal katika damu ya mgonjwa. Kingamwili zilizogunduliwa katika mtihani wa Wassermann zilikuwa antibodies za antiphospholipid ambazo hazipatikani kwa T. pallidum. Uwepo wao unaweza kusaidia katika utambuzi wa kaswende, lakini kwa sababu wao ni nonspecific, wanaweza pia kusababisha matokeo ya uongo chanya kwa wagonjwa wenye magonjwa mengine na hali autoimmune. Mtihani wa awali wa Wasserman umebadilishwa zaidi ya miaka ili kupunguza uongo na sasa unajulikana kama mtihani wa Maabara ya Utafiti wa Magonjwa ya Venereal, unaojulikana zaidi kwa kifupi chake, mtihani wa VDRL.

Kufanya mtihani wa VDRL, serum ya mgonjwa au maji ya mgongo wa ubongo huwekwa kwenye slide na mchanganyiko wa cardiolipin (phospholipid ya antijeni inayopatikana katika utando wa mitochondrial wa vimelea mbalimbali), lecithin, na cholesterol. lecithin na cholesterol huimarisha mmenyuko na kupunguza chanya cha uongo. Antibodies ya kupambana na treponemal kutoka serum ya mgonjwa aliyeambukizwa itamfunga cardiolipin na kuunda flocculant. Ingawa mtihani wa VDRL ni maalum zaidi kuliko assay ya awali ya Wassermann, chanya cha uongo bado kinaweza kutokea kwa wagonjwa wenye magonjwa ya autoimmune ambayo husababisha uharibifu mkubwa wa seli (kwa mfano, lupus erythematosus ya utaratibu).

Tathmini ya neutralization

Ili kusababisha maambukizi, virusi lazima zifunge kwa receptors kwenye seli za jeshi. Antibodies ya antiviral inaweza kuondokana na maambukizi ya virusi kwa mipako ya virions, kuzuia kisheria (Mchoro 18.1.6). Shughuli hii neutralizes virions na inaweza kusababisha malezi ya complexes kubwa antibody-virusi (ambayo ni urahisi kuondolewa kwa phagocytosis) au kwa antibody kisheria kwa virusi na kuzuia kisheria yake kwa jeshi receptors seli. Shughuli hii ya neutralization ni msingi wa majaribio ya neutralization, majaribio nyeti kutumika kwa ajili ya uchunguzi wa maambukizi ya virusi.

Wakati virusi huambukiza seli, mara nyingi husababisha uharibifu (madhara ya cytopathic) ambayo yanaweza kujumuisha lysis ya seli za jeshi. Madhara ya cytopathic yanaweza kutazamwa kwa kukua seli za jeshi katika sahani ya petri, kufunika seli na safu nyembamba ya agar, na kisha kuongeza virusi (tazama Kutengwa, Utamaduni, na Utambulisho wa Virusi). Virusi huenea polepole sana kupitia agar. Virusi itaingia kiini cha jeshi, kuenea (kusababisha uharibifu wa seli), kutolewa kutoka kwenye kiini cha jeshi kilichokufa, na kisha uende kwenye seli za jirani. Kama seli zaidi na zaidi zinakufa, plaques ya seli zilizokufa zitaunda (Kielelezo\(\PageIndex{6}\)).

Wakati wa maambukizi ya virusi, mgonjwa atapanda majibu ya antibody kwa virusi, na tunaweza kupima antibodies hizo kwa kutumia uchunguzi wa kupunguza plaque. Ili kufanya uchunguzi, dilution ya serial hufanyika kwenye sampuli ya serum. Kila dilution huchanganywa na kiasi sanifu cha virusi vya mtuhumiwa. Antibodies yoyote ya virusi maalum katika seramu itapunguza baadhi ya virusi. Kusimamishwa huongezwa kwa seli za mwenyeji katika utamaduni ili kuruhusu virusi yoyote isiyo na neutralized kuambukiza seli na kuunda plaques baada ya siku kadhaa. Jina hilo linafafanuliwa kama usawa wa dilution ya juu inayoonyesha kupungua kwa 50% katika plaques. Titer daima imeelezwa kama idadi nzima. Kwa mfano, ikiwa dilution ya 1/64 ilikuwa dilution ya juu ili kuonyesha kupungua kwa plaque 50%, basi titer ni 64.

Uwepo wa antibodies katika serum ya mgonjwa haituambii kama mgonjwa sasa ameambukizwa au aliambukizwa katika siku za nyuma. Maambukizi ya sasa yanaweza kutambuliwa kwa kusubiri wiki mbili na kupima sampuli nyingine ya seramu. Ongezeko la mara nne katika neutralizing titer katika sampuli hii ya pili inaonyesha maambukizi mapya.

Kielelezo\(\PageIndex{6}\): Katika upimaji wa neutralization, antibodies katika serum mgonjwa neutralize virusi aliongeza kwa visima, kuzuia malezi ya plaques. Katika uchunguzi ulioonyeshwa, visima vilivyo na plaques nyingi (patches nyeupe) vina mkusanyiko mdogo wa antibodies. Visima vilivyo na plaques chache vina mkusanyiko mkubwa wa antibodies. (mikopo: mabadiliko ya kazi na Vituo vya Kudhibiti na Kuzuia Magonjwa)

Zoezi\(\PageIndex{3}\)

Katika upimaji wa neutralization, ikiwa serum ya mgonjwa ina idadi kubwa ya antibodies ya antiviral, ungependa kutarajia kuona plaques zaidi au chache?

Immunoelectrophor

Wakati mgonjwa ameinua viwango vya protini katika damu au anapoteza protini katika mkojo, daktari mara nyingi ataagiza uchunguzi wa electrophoresis ya polyacrylamide (PAGE) (tazama Visualizing na Tabia ya DNA, RNA, na Protini). Uchunguzi huu unalinganisha wingi wa jamaa wa aina mbalimbali za protini za seramu. Mifumo isiyo ya kawaida ya electrophoresis ya protini inaweza kujifunza zaidi kwa kutumia immunoelectrophoresis (IEP). IEP huanza kwa kuendesha PAGE. Antisera dhidi ya protini zilizochaguliwa za serum zinaongezwa kwenye mabwawa yanayofanana na kufuatilia electrophoresis, na kutengeneza arcs za precipitin sawa na zile zinazoonekana katika uchunguzi wa Ouchterlony (Kielelezo\(\PageIndex{7}\)). Hii inaruhusu utambulisho wa protini zisizo za kawaida za immunoglobulin katika sampuli.

IEP ni muhimu hasa katika uchunguzi wa myeloma nyingi, kansa ya seli za kuzuia antibody-secreting. Wagonjwa wenye myeloma nyingi hawawezi kuzalisha kingamwili zenye afya; badala yake huzalisha kingamwili zisizo za kawaida ambazo ni protini za monoclonal (M protini). Hivyo, wagonjwa na myeloma nyingi sasa na viwango vya juu serum protini kwamba kuonyesha bendi tofauti katika gamma globulin mkoa wa protini electrophoresis gel na Mwiba mkali (katika M protini) juu ya densitometer Scan badala ya kawaida pana smear (Kielelezo\(\PageIndex{7}\)). Wakati antibodies dhidi ya aina mbalimbali za antibody minyororo nzito na mwanga hutumiwa kuunda arcs precipitin, protini M kusababisha arcs wazi skewed dhidi ya darasa moja ya mlolongo nzito na darasa moja ya mlolongo mwanga kama inavyoonekana katika Kielelezo\(\PageIndex{7}\).

Kielelezo\(\PageIndex{7}\): (a) Grafu hii inaonyesha vipimo vya kawaida vya protini za seramu. (b) Picha hii inaonyesha immunoelectrophoresis ya mkojo. Baada ya electrophoresis, antisera ziliongezwa kwenye mabwawa na arcs za precipitin ziliundwa, kuonyesha usambazaji wa protini maalum. Arcs zilizopigwa (mishale) husaidia kutambua myeloma nyingi. (mikopo a, b: mabadiliko ya kazi na Izawa S, Akimoto T, Ikeuchi H, Kusano E, Nagata D)

Protini Electrophoresis na Tabia ya Muundo wa Immunoglobulin

Ujio wa electrophoresis hatimaye ulisababisha kutafiti na kuelewa muundo wa antibodies. Wakati mwanabiokemia wa Uswidi Arne Tiselius (1902—1971) alipochapisha matokeo ya kwanza ya electrophoresis ya protini mnamo mwaka 1937, ² aliweza kutambua albumini ya protini (protini ndogo zaidi na yenye wingi wa seramu) kwa bendi kali iliyozalishwa katika gel. Protini nyingine za seramu hazikuweza kutatuliwa katika electrophoresis rahisi ya protini, kwa hiyo aliita bendi tatu pana, na protini nyingi katika kila bendi, alpha, beta, na gamma globulini. Miaka miwili baadaye, mwanaimunolojia wa Kimarekani Elvin Kabat (1914—2000) alisafiri kwenda Uswidi kufanya kazi na Tiselius kwa kutumia mbinu hii mpya na kuonyesha kuwa kingamwili zilihamia kama gamma globulini. ³ Kwa uelewa huu mpya kwa mkono, watafiti hivi karibuni kujifunza kwamba myeloma nyingi, kwa sababu ni kansa ya seli za antibody-secreting, inaweza kuwa tentatively kukutwa na uwepo wa kubwa M Mwiba katika eneo gamma-globulin na electrophoresis protini. Kabla ya ugunduzi huu, tafiti juu ya muundo wa immunoglobulini zilikuwa ndogo, kwa sababu ya ugumu wa kupata sampuli safi kujifunza. Sera kutoka kwa wagonjwa wengi wa myeloma imeonekana kuwa chanzo bora cha immunoglobulin yenye utajiri wa monoclonal, kutoa malighafi kwa ajili ya masomo zaidi ya miaka 20-plus ambayo ilisababisha elucidation ya muundo wa immunoglobulin.

Kielelezo\(\PageIndex{8}\): Mwelekeo wa Electrophoresis wa myeloma (kulia) na sera ya kawaida (kushoto). Protini zimeharibiwa; wakati wiani wa kila bendi unapimwa na densitometry, data huzalisha grafu ya bar upande wa kulia. Jeli zote mbili zinaonyesha bendi ya mnene inayotarajiwa ya albumini chini na kiwiba kisicho cha kawaida katika eneo la gamma-globulini. (mikopo: mabadiliko ya kazi na Soodgupta D, Hurchla MA, Jiang M, Zheleznyak A, Weilbaecher KN, Anderson CJ, Tomasson MH, Shokeen M)

Zoezi\(\PageIndex{4}\)

Kwa ujumla, mtihani wa immunoelectrophoresis unafikia nini?

Uchunguzi wa immunoblot: Msamaha wa Magharibi

Baada ya kufanya electrophoresis ya protini ya gel, protini maalum zinaweza kutambuliwa katika gel kwa kutumia antibodies. Mbinu hii inajulikana kama waa magharibi. Kufuatia kujitenga kwa protini na PAGE, antigens za protini katika gel zinahamishiwa na immobilized kwenye membrane ya nitrocellulose. Utando huu unaweza kuwa wazi kwa antibody ya msingi inayozalishwa ili kumfunga kwa protini ya riba. Antibody ya pili iliyo na beacon ya Masi itawafunga kwa kwanza. Kingamwili hizi za sekondari zinaunganishwa na molekuli nyingine kama vile enzyme au fluorophore (molekuli inayofluoresces inapofurahi na mwanga). Unapotumia antibodies pamoja na enzymes, substrate ya chromogenic kwa enzyme Substrate hii ni kawaida isiyo na rangi lakini itaendeleza rangi mbele ya antibody. Fluorescence au substrate Coloring inatambua eneo la protini maalum katika utando ambayo antibodies ni amefungwa (Kielelezo\(\PageIndex{9}\)).

Kwa kawaida, antibodies ya polyclonal hutumiwa kwa majaribio ya magharibi ya magharibi. Wao ni nyeti zaidi kuliko MABs kwa sababu ya uwezo wao wa kumfunga kwa epitopes mbalimbali ya antigen ya msingi, na ishara kutoka antibodies polyclonal ni kawaida nguvu zaidi kuliko ile kutoka MABs. Kingamwili za monoclonal pia zinaweza kutumiwa; hata hivyo, ni ghali zaidi kuzalisha na hazina nyeti, kwani zina uwezo wa kutambua epitope moja maalum.

Tofauti kadhaa za waa magharibi ni muhimu katika utafiti. Katika utando wa kusini magharibi, protini zinatenganishwa na SDS-PAGE, zimefunikwa kwenye utando wa nitrocellulose, zinaruhusiwa kurejesha tena, na kisha zinatumika kwa uchunguzi wa DNA wa fluorescently au radioactively; madhumuni ya kusini magharibi ni kutambua mwingiliano maalum wa DNA-protini. Vitalu vya magharibi ya mbali hufanywa ili kuamua mwingiliano wa protini-protini kati ya protini zisizohamishika (zilizotengwa na SDS-PAGE, zimefutwa kwenye membrane ya nitrocellulose, na kuruhusiwa kubadili tena) na probes za protini zisizo za antibody. Protini zisizo za antibody ambazo zinaingiliana na protini zisizo na immobilized katika mmea wa magharibi ya mbali zinaweza kugunduliwa na radiolabeling, fluorescence, au matumizi ya antibody yenye beacon ya molekuli ya enzymatic.

Kielelezo\(\PageIndex{9}\): (a) Mchoro huu unafupisha mchakato wa kufuta magharibi. Antibodies hutumiwa kutambua bendi maalum kwenye gel ya protini. (b) mtihani wa magharibi wa damu kwa antibodies dhidi ya VVU. Mstari wa juu ni udhibiti hasi; mstari unaofuata ni udhibiti mzuri. Vipande viwili vya chini ni sampuli za seramu za mgonjwa zenye antibodies. (mikopo a: mabadiliko ya kazi na “Bensacount” /Wikimedia Commons)

Zoezi\(\PageIndex{5}\)

Ni kazi gani ya enzyme katika mtihani wa immunoblot?

Immunoassay inayojumuisha

Moja ya kazi muhimu za antibodies ni uanzishaji (fixation) ya inayosaidia. Wakati antibody kumfunga kwa bakteria, kwa mfano, baadhi ya protini inayosaidia kutambua antibody amefungwa na kuamsha cascade inayosaidia. Katika kukabiliana, protini nyingine inayosaidia hufunga kwa bakteria ambapo baadhi hutumika kama opsonini ili kuongeza ufanisi wa phagocytosis na wengine huunda mashimo katika utando wa seli za bakteria ya gramu-hasi, na kusababisha lisisi. Shughuli hii ya lytic inaweza kutumika kuchunguza uwepo wa antibodies dhidi ya antigens maalum katika serum.

Siri nyekundu za damu ni seli nzuri za kiashiria za kutumia wakati wa kutathmini cytolysis inayosaidia. Hemolysis ya seli nyekundu za damu hutoa hemoglobin, ambayo ni rangi nyekundu, na hemolysis ya hata idadi ndogo ya seli nyekundu itasababisha suluhisho kuwa nyekundu (Kielelezo\(\PageIndex{10}\)). Tabia hii ina jukumu katika mtihani wa kuimarisha, ambayo inaruhusu kugundua antibodies dhidi ya vimelea maalum. Mtihani wa kuwabainishia inayosaidia unaweza kutumika kuangalia kwa kingamwili dhidi ya vimelea ambavyo ni vigumu kwa utamaduni katika maabara kama vile fungi, virusi, au bakteria Chlamydia.

Ili kufanya mtihani wa kuimarisha, antigen kutoka kwa pathogen huongezwa kwa serum ya mgonjwa. Ikiwa antibodies kwa antigen zipo, antibody itamfunga antigen na kurekebisha inayosaidia yote inapatikana. Wakati seli nyekundu za damu na antibodies dhidi ya seli nyekundu za damu ni hatimaye aliongeza kwa mchanganyiko, hakutakuwa na inayosaidia kushoto lyse seli nyekundu. Hivyo, ikiwa suluhisho linabakia wazi, mtihani ni chanya. Ikiwa hakuna antibodies ya antipathogen katika serum ya mgonjwa, antibodies zilizoongezwa zitaamsha inayosaidia kwa lyse seli nyekundu, kutoa mtihani hasi (Kielelezo\(\PageIndex{10}\)).

Kielelezo\(\PageIndex{10}\): Mtihani wa kuimarisha hutumiwa kuamua kama seramu ya mgonjwa ina antibodies kwa antigen maalum. Kama ni hivyo, inayosaidia kuwabainishia kutokea, na hakutakuwa na inayosaidia inapatikana kwa lyse kondoo kondoo kondoo seli nyekundu za damu kwamba ni aliongeza kwa ufumbuzi katika hatua inayofuata. Ikiwa sampuli haina antibodies kwa antigen, hemolysis ya seli za damu za kondoo zitazingatiwa.

Unganisha na Kujifunza

Tazama video hii ili uone muhtasari wa hatua za mtihani wa kuimarisha.

Zoezi\(\PageIndex{6}\)

Katika mtihani wa kuimarisha, ikiwa seramu inarudi nyekundu, je, mgonjwa ana antibodies kwa antigen au la? Eleza.

\(\PageIndex{1}\)Jedwali linafupisha aina mbalimbali za majaribio ya antibody-antigen yaliyojadiliwa katika sehemu hii.

Jedwali\(\PageIndex{1}\): Utaratibu wa Chagua vipimo vya Antibody-Antigen

Aina ya Uchunguzi	Mfumo	Mifano
Upepo wa mvua	Antibody hufunga kwa antigen ya mumunyifu, na kutengeneza precipitin inayoonekana	Precipitin pete mtihani taswira kimiani malezi katika ufumbuzi
		Immunoelectrophoresis kuchunguza usambazaji wa antigens zifuatazo electrophoresis
		Ouchterlony assay kulinganisha antigens mbalimbali
		Upimaji wa immunodiffusion ya radial ili kupima antigens
Flocculation	Antibody hufunga kwa molekuli zisizo na nguvu katika kusimamishwa, na kutengeneza aggregates inayoonekana	VDRL mtihani kwa kaswisi
Neutralization	Antibody hufunga kwa virusi, kuzuia kuingia kwa virusi kwenye seli za lengo na kuzuia malezi ya plaques	Uchunguzi wa kupunguza plaque kwa kuchunguza uwepo wa antibodies neutralizing katika sera ya mgonjwa
Kuongeza uanzishaji	Antibody kumfunga kwa antigen, inducing inayosaidia uanzishaji na kuacha hakuna inayosaidia seli lyse nyekundu za damu	Jaribio la kurekebisha kwa antibodies ya mgonjwa dhidi ya bakteria ngumu ya utamaduni kama vile Chlamydia

Dhana muhimu na Muhtasari

• Wakati wa sasa katika uwiano sahihi, antibody na antigen zitaunda precipitin, au safu ambayo inatoka nje ya suluhisho.
• Mtihani wa pete ya precipitin inaweza kutumika kutazama malezi ya kimiani katika suluhisho. Uchunguzi wa Ouchterlony unaonyesha malezi ya bandia katika gel. Uchunguzi wa immunodiffusion ya radial hutumiwa kupima antigen kwa kupima ukubwa wa eneo la mvua katika gel iliyoingizwa na antibodies.
• Antigens zisizo na nguvu katika kusimamishwa zitaunda flocculants wakati amefungwa na antibodies. Hii ni msingi wa mtihani wa VDRL kwa kaswisi ambayo antibodies ya kupambana na treponemal hufunga kwa cardiolipin katika kusimamishwa.
• Maambukizi ya virusi yanaweza kugunduliwa kwa kupima antibodies ya virusi vya neutralizing katika serum ya mgonjwa.
• Masomo tofauti ya antibody katika plasma au serum yanatambuliwa kwa kutumia immunoelectrophoresis.
• Uwepo wa antijeni maalum (k.m., protini za bakteria au virusi) katika seramu unaweza kuonyeshwa na vipimo vya matone ya magharibi, ambapo protini huhamishiwa kwenye utando wa nitrocellulose na kutambuliwa kwa kutumia kingamwili zilizoandikwa.
• Katika mtihani wa kuimarisha, inayosaidia hutumiwa kuchunguza antibodies dhidi ya vimelea mbalimbali.

maelezo ya chini

1. 1 Ouchterlony, Örjan, “Katika Vitro Method kwa ajili ya kupima Toxin-kuzalisha uwezo wa Bakteria Diphtheria,” Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica 26, № 4 (1949): 516-24.
2. 2 Tiselius, Arne, “Electrophoresis ya Serum Globulin: Electrophoretic Uchambuzi wa Sera Kawaida na Immune,” Biochemical Journal 31, № 9 (1937): 1464.
3. 3 Tiselius, Arne na Elvin A. Kabat. “Utafiti wa Electrophoretic wa Sera ya Kinga na Maandalizi ya Antibody yaliyotakaswa,” Jarida la Tiba ya majaribio 69, namba 1 (1939): 119-31.