12.3: Métodos do genoma completo e aplicações industriais

Objetivos de

• Explicar os usos das análises comparativas de todo o genoma
• Resuma as vantagens dos produtos farmacêuticos geneticamente modificados

Os avanços na biologia molecular levaram à criação de campos inteiramente novos da ciência. Entre eles estão campos que estudam aspectos de genomas inteiros, coletivamente chamados de métodos do genoma completo. Nesta seção, forneceremos uma breve visão geral dos campos do genoma completo da genômica, transcriptômica e proteômica.

Genômica, Transcriptômica e Proteômica

O estudo e a comparação de genomas inteiros, incluindo o conjunto completo de genes e sua sequência e organização de nucleotídeos, são chamados de genômica. Este campo tem um grande potencial para futuros avanços médicos por meio do estudo do genoma humano, bem como dos genomas de organismos infecciosos. A análise de genomas microbianos contribuiu para o desenvolvimento de novos antibióticos, ferramentas de diagnóstico, vacinas, tratamentos médicos e técnicas de limpeza ambiental.

O campo da transcriptômica é a ciência de toda a coleção de moléculas de mRNA produzidas pelas células. Cientistas comparam padrões de expressão gênica entre células hospedeiras infectadas e não infectadas, obtendo informações importantes sobre as respostas celulares a doenças infecciosas. Além disso, a transcriptômica pode ser usada para monitorar a expressão gênica de fatores de virulência em microrganismos, ajudando os cientistas a compreender melhor os processos patogênicos desse ponto de vista.

Quando a genômica e a transcriptômica são aplicadas a comunidades microbianas inteiras, usamos os termos metagenômica e metatranscriptômica, respectivamente. A metagenômica e a metatranscriptômica permitem que os pesquisadores estudem genes e expressão gênica a partir de uma coleção de várias espécies, muitas das quais podem não ser facilmente cultivadas ou cultivadas em laboratório. Um microarranjo de DNA (discutido na seção anterior) pode ser usado em estudos metagenômicos.

Outra aplicação clínica promissora da genômica e da transcriptômica é a farmacogenômica, também chamada de toxicogenômica, que envolve avaliar a eficácia e a segurança de medicamentos com base nas informações da sequência genômica de um indivíduo. As respostas genômicas aos medicamentos podem ser estudadas usando animais experimentais (como ratos de laboratório ou camundongos) ou células vivas em laboratório antes de iniciar estudos com humanos. Mudanças na expressão gênica na presença de um medicamento às vezes podem ser um indicador precoce do potencial de efeitos tóxicos. Informações pessoais sobre a sequência do genoma podem algum dia ser usadas para prescrever medicamentos que serão mais eficazes e menos tóxicos com base no genótipo de cada paciente.

O estudo da proteômica é uma extensão da genômica que permite aos cientistas estudar todo o complemento de proteínas de um organismo, chamado proteoma. Embora todas as células de um organismo multicelular tenham o mesmo conjunto de genes, células em vários tecidos produzem diferentes conjuntos de proteínas. Assim, o genoma é constante, mas o proteoma varia e é dinâmico dentro de um organismo. A proteômica pode ser usada para estudar quais proteínas são expressas sob várias condições dentro de um único tipo de célula ou para comparar padrões de expressão de proteínas entre diferentes organismos.

A doença mais proeminente que está sendo estudada com abordagens proteômicas é o câncer, mas essa área de estudo também está sendo aplicada a doenças infecciosas. Atualmente, pesquisas estão em andamento para examinar a viabilidade do uso de abordagens proteômicas para diagnosticar vários tipos de hepatite, tuberculose e infecção por HIV, que são bastante difíceis de diagnosticar usando as técnicas atualmente disponíveis. ¹

Uma análise proteômica recente e em desenvolvimento depende da identificação de proteínas chamadas biomarcadores, cuja expressão é afetada pelo processo da doença. Atualmente, os biomarcadores estão sendo usados para detectar várias formas de câncer, bem como infecções causadas por patógenos, como Yersinia pestis e vírus Vaccinia. ²

Outras ciências “-ômicas” relacionadas à genômica e proteômica incluem metabolômica, glicômica e lipidômica, que se concentram no conjunto completo de metabólitos, açúcares e lipídios de moléculas pequenas, respectivamente, encontrados dentro de uma célula. Por meio dessas várias abordagens globais, os cientistas continuam coletando, compilando e analisando grandes quantidades de informações genéticas. Esse campo emergente da bioinformática pode ser usado, entre muitas outras aplicações, como pistas sobre o tratamento de doenças e a compreensão do funcionamento das células.

Além disso, os pesquisadores podem usar a genética reversa, uma técnica relacionada à análise mutacional clássica, para determinar a função de genes específicos. Os métodos clássicos de estudo da função gênica envolviam a busca dos genes responsáveis por um determinado fenótipo. A genética reversa usa a abordagem oposta, começando com uma sequência específica de DNA e tentando determinar qual fenótipo ela produz. Como alternativa, os cientistas podem associar genes conhecidos (chamados genes repórteres) que codificam características facilmente observáveis aos genes de interesse, e a localização da expressão desses genes de interesse pode ser facilmente monitorada. Isso fornece ao pesquisador informações importantes sobre o que o produto genético pode estar fazendo ou onde ele está localizado no organismo. Os genes repórteres comuns incluem a lacZ bacteriana, que codifica a beta-galactosidase e cuja atividade pode ser monitorada por mudanças na cor da colônia na presença de X-gal, conforme descrito anteriormente, e o gene que codifica a proteína verde fluorescente da medusa (GFP), cuja atividade pode ser visualizada em colônias sob exposição à luz ultravioleta (Figura\(\PageIndex{1}\)).

Figura\(\PageIndex{1}\): (a) O gene que codifica a proteína de fluorescência verde é um gene repórter comumente usado para monitorar padrões de expressão gênica em organismos. Sob luz ultravioleta, o GFP fluoresce. Aqui, dois ratos estão expressando GFP, enquanto o mouse do meio não. (b) O GFP também pode ser usado como um gene repórter em bactérias. Aqui, uma placa contendo colônias bacterianas expressando GFP é mostrada. (c) A triagem azul-branca em bactérias é realizada através do uso do gene repórter LacZ, seguido pelo revestimento de bactérias em meio contendo X-gal. A clivagem da X-gal pela enzima LacZ resulta na formação de colônias azuis. (crédito a: modificação da obra de Ingrid Moen, Charlotte Jevne, Jian Wang, Karl-Henning Kalland, Martha Chekenya, Lars A Akslen, Linda Sleire, Per Ø Enger, Rolf K Reed, Anne M Øyan, Linda EB Stuhr; crédito b: modificação da obra de “2.5Jigen.com” /Flickr; crédito c: modificação do trabalho da American Society para Microbiologia)

Exercício\(\PageIndex{1}\)

1. Como a genômica é diferente da genética tradicional?
2. Se você quisesse estudar como duas células diferentes no corpo respondem a uma infecção, qual campo —ômico você aplicaria?
3. Para que são usados os biomarcadores descobertos na proteômica?

Foco clínico: Resolução

Como os sintomas de Kayla eram persistentes e graves o suficiente para interferir nas atividades diárias, o médico de Kayla decidiu solicitar alguns exames laboratoriais. O médico coletou amostras de sangue de Kayla, líquido cefalorraquidiano (LCR) e líquido sinovial (de um de seus joelhos inchados) e solicitou a análise de PCR em todas as três amostras. Os testes de PCR no LCR e no líquido sinovial deram positivo para a presença de Borrelia burgdorferi, a bactéria causadora da doença de Lyme.

O médico de Kayla prescreveu imediatamente um ciclo completo do antibiótico doxiciclina. Felizmente, Kayla se recuperou totalmente em poucas semanas e não sofreu dos sintomas de longo prazo da síndrome da doença de Lyme pós-tratamento (PTLDS), que afeta 10 a 20% dos pacientes com doença de Lyme. Para evitar futuras infecções, o médico de Kayla a aconselhou a usar repelente de insetos e usar roupas de proteção durante suas aventuras ao ar livre. Essas medidas podem limitar a exposição a carrapatos portadores de Lyme, que são comuns em muitas regiões dos Estados Unidos durante os meses mais quentes do ano. Kayla também foi aconselhada a criar o hábito de se examinar em busca de carrapatos após retornar das atividades ao ar livre, pois a remoção imediata de um carrapato reduz muito as chances de infecção.

A doença de Lyme costuma ser difícil de diagnosticar. B. burgdorferi não é facilmente cultivada em laboratório, e os sintomas iniciais podem ser muito leves e semelhantes aos de muitas outras doenças. Mas, se não forem tratados, os sintomas podem se tornar bastante graves e debilitantes. Além de dois testes de anticorpos, que foram inconclusivos no caso de Kayla, e do teste de PCR, um Southern blot poderia ser usado com sondas de DNA específicas de B. burgdorferi para identificar o DNA do patógeno. O sequenciamento de genes de proteínas de superfície de espécies de Borrelia também está sendo usado para identificar cepas dentro da espécie que podem ser mais facilmente transmitidas aos humanos ou causar doenças mais graves.

Tecnologia de DNA recombinante e produção farmacêutica

A engenharia genética forneceu uma maneira de criar novos produtos farmacêuticos chamados de produtos farmacêuticos de DNA recombinante. Esses produtos incluem antibióticos, vacinas e hormônios usados para tratar várias doenças. A tabela\(\PageIndex{1}\) lista exemplos de produtos de DNA recombinante e seus usos.

Por exemplo, as vias naturais de síntese de antibióticos de vários Streptomyces spp., há muito conhecidas por suas capacidades de produção de antibióticos, podem ser modificadas para melhorar a produção ou criar novos antibióticos por meio da introdução de genes que codificam enzimas adicionais. Mais de 200 novos antibióticos foram gerados por meio da inativação direcionada de genes e da nova combinação de genes de síntese de antibióticos em hospedeiros Streptomyces produtores de antibióticos. ³

A engenharia genética também é usada para fabricar vacinas de subunidade, que são mais seguras do que outras vacinas porque contêm apenas uma única molécula antigênica e não possuem qualquer parte do genoma do patógeno (consulte Vacinas). Por exemplo, uma vacina para a hepatite B é criada inserindo um gene que codifica uma proteína de superfície da hepatite B em uma levedura; a levedura então produz essa proteína, que o sistema imunológico humano reconhece como um antígeno. O antígeno da hepatite B é purificado a partir de culturas de leveduras e administrado aos pacientes como uma vacina. Embora a vacina não contenha o vírus da hepatite B, a presença da proteína antigênica estimula o sistema imunológico a produzir anticorpos que protegerão o paciente contra o vírus em caso de exposição. ^{4 5}

A engenharia genética também tem sido importante na produção de outras proteínas terapêuticas, como insulina, interferons e hormônio do crescimento humano, para tratar uma variedade de condições médicas humanas. Por exemplo, em certa época, era possível tratar o diabetes apenas dando aos pacientes insulina suína, o que causava reações alérgicas devido a pequenas diferenças entre as proteínas expressas na insulina humana e suína. No entanto, desde 1978, a tecnologia de DNA recombinante tem sido usada para produzir grandes quantidades de insulina humana usando E. coli em um processo relativamente barato que produz um produto farmacêutico mais consistentemente eficaz. Os cientistas também criaram E. coli geneticamente modificada, capaz de produzir hormônio do crescimento humano (HGH), que é usado para tratar distúrbios do crescimento em crianças e alguns outros distúrbios em adultos. O gene HGH foi clonado de uma biblioteca de cDNA e inserido nas células de E. coli clonando-o em um vetor bacteriano. Eventualmente, a engenharia genética será usada para produzir vacinas de DNA e várias terapias genéticas, bem como medicamentos personalizados para combater o câncer e outras doenças.

Tabela\(\PageIndex{1}\): Alguns produtos e aplicações farmacêuticas geneticamente modificados

Produto de DNA recombinante	Aplicação
Peptídeo natriurético atrial	Tratamento de doenças cardíacas (por exemplo, insuficiência cardíaca congestiva), doença renal, hipertensão arterial
DNase	Tratamento de secreções pulmonares viscosas na fibrose cística
Eritropoetina	Tratamento da anemia grave com lesão renal
Fator VIII	Tratamento da hemofilia
Vacina contra hepatite	Prevenção da infecção por hepatite B
Hormônio do crescimento humano	Tratamento da deficiência de hormônio do crescimento, síndrome de Turner, queimaduras
Insulina humana	Tratamento do diabetes
Interferões	Tratamento da esclerose múltipla, vários tipos de câncer (por exemplo, melanoma), infecções virais (por exemplo, hepatite B e C)
Tetracenomicinas	Usado como antibióticos
Ativador de plasminogênio tecidual	Tratamento da embolia pulmonar no AVC isquêmico, infarto do miocárdio

Exercício\(\PageIndex{2}\)

1. Qual bactéria foi geneticamente modificada para produzir insulina humana para o tratamento do diabetes?
2. Explique como os microrganismos podem ser projetados para produzir vacinas.

Tecnologia de interferência de RNA

Em Estrutura e Função do RNA, descrevemos a função do mRNA, rRNA e tRNA. Além desses tipos de RNA, as células também produzem vários tipos de pequenas moléculas de RNA não codificadoras que estão envolvidas na regulação da expressão gênica. Isso inclui moléculas de RNA antisense, que são complementares às regiões de moléculas específicas de mRNA encontradas em procariontes e células eucarióticas. As moléculas de RNA não codificadoras desempenham um papel importante na interferência de RNA (RNAi), um mecanismo regulador natural pelo qual as moléculas de mRNA são impedidas de guiar a síntese de proteínas. A interferência de RNA de genes específicos resulta do emparelhamento básico de moléculas curtas de RNA antisense de fita simples com regiões dentro de moléculas complementares de mRNA, impedindo a síntese de proteínas. As células usam interferência de RNA para se protegerem da invasão viral, que pode introduzir moléculas de RNA de fita dupla como parte do processo de replicação viral (Figura\(\PageIndex{2}\)).

Figura\(\PageIndex{2}\): Células como a célula eucariótica mostrada neste diagrama geralmente produzem pequenas moléculas de RNA antisense com sequências complementares a moléculas específicas de mRNA. Quando uma molécula de RNA antisense é ligada a uma molécula de mRNA, o mRNA não pode mais ser usado para direcionar a síntese protéica. (crédito: modificação do trabalho de Robinson R)

Atualmente, os pesquisadores estão desenvolvendo técnicas para imitar o processo natural de interferência do RNA como forma de tratar infecções virais em células eucarióticas. A tecnologia de interferência de RNA envolve o uso de pequenos RNAs interferentes (siRNAs) ou microRNAs (miRNAs\(\PageIndex{3}\)) (Figura). Os siRNAs são completamente complementares à transcrição de mRNA de um gene específico de interesse, enquanto os miRNAs são principalmente complementares. Esses RNAs de fita dupla estão ligados à DICER, uma endonuclease que cliva o RNA em moléculas curtas (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). Os RNAs são então ligados ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), uma ribonucleoproteína. O complexo siRNA-RISC se liga ao mRNA e o cliva. Para o miRNA, apenas uma das duas cadeias se liga ao RISC. O complexo miRNA-RISC então se liga ao mRNA, inibindo a tradução. Se o miRNA for completamente complementar ao gene alvo, o mRNA pode ser clivado. Juntos, esses mecanismos são conhecidos como silenciamento de genes.

Figura\(\PageIndex{3}\): Este diagrama ilustra o processo de uso de siRNA ou miRNA em uma célula eucariótica para silenciar genes envolvidos na patogênese de várias doenças. (crédito: modificação do trabalho do National Center for Biotechnology Information)

Conceitos principais e resumo

• A ciência da genômica permite que os pesquisadores estudem organismos em um nível holístico e tem muitas aplicações de relevância médica.
• A transcriptômica e a proteômica permitem que os pesquisadores comparem os padrões de expressão gênica entre diferentes células e são muito promissoras para entender melhor as respostas globais a várias condições.
• As várias tecnologias —ômicas se complementam e, juntas, fornecem uma imagem mais completa do estado de um organismo ou comunidade microbiana (metagenômica).
• A análise necessária para grandes conjuntos de dados produzidos por meio de genômica, transcriptômica e proteômica levou ao surgimento da bioinformática.
• Genes repórteres que codificam características facilmente observáveis são comumente usados para rastrear padrões de expressão gênica de genes de função desconhecida.
• O uso da tecnologia de DNA recombinante revolucionou a indústria farmacêutica, permitindo a rápida produção de produtos farmacêuticos de DNA recombinante de alta qualidade usados para tratar uma ampla variedade de condições humanas.
• A tecnologia de interferência de RNA é muito promissora como método de tratamento de infecções virais, silenciando a expressão de genes específicos.

Notas de pé

1. 1 Lista de E.O., D.E. Berryman, B. Bower, L. Sackmann-Sala, E. Gosney, J. Ding, S. Okada e J.J. Kopchick. “O uso da proteômica para estudar doenças infecciosas”. Distúrbios infecciosos - alvos de medicamentos (antigamente atuais alvos de medicamentos - distúrbios infecciosos) 8 no. 1 (2008): 31—45.
2. 2 Mohan Natesan e Robert G. Ulrich. “Microarranjos de proteínas e biomarcadores de doenças infecciosas”. Jornal Internacional de Ciências Moleculares 11 no. 12 (2010): 5165—5183.
3. 3 Jose-Luis Adrio e Arnold L. Demain. “Organismos recombinantes para produção de produtos industriais”. Bioengineered Bugs 1 no. 2 (2010): 116—131.
4. 4 Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA. “Tipos de vacinas”. 2013. www.vaccines.gov/more_info/types/ #subunit. Acessado em 27 de maio de 2016.
5. 5 A lista de medicamentos da Internet. Recombivax. 2015. http://www.rxlist.com/recombivax-drug.htm. Acessado em 27 de maio de 2016.