2.3: Instrumentos de microscopia

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objetivos de aprendizagem

Identifique e descreva as partes de um microscópio de campo claro
Calcule a ampliação total para um microscópio composto
Descreva as características distintivas e os usos típicos de vários tipos de microscópios de luz, microscópios eletrônicos e microscópios de sonda de varredura

Os pioneiros da microscopia abriram uma janela para o mundo invisível dos microrganismos. Mas a microscopia continuou avançando nos séculos seguintes. Em 1830, Joseph Jackson Lister criou um microscópio de luz essencialmente moderno. O século XX viu o desenvolvimento de microscópios que aproveitaram a luz não visível, como a microscopia de fluorescência, que usa uma fonte de luz ultravioleta, e a microscopia eletrônica, que usa feixes de elétrons de comprimento de onda curto. Esses avanços levaram a grandes melhorias na ampliação, resolução e contraste. Em comparação, os microscópios relativamente rudimentares de van Leeuwenhoek e seus contemporâneos eram muito menos poderosos do que os microscópios mais básicos em uso atualmente. Nesta seção, examinaremos a ampla variedade de tecnologias microscópicas modernas e aplicações comuns para cada tipo de microscópio.

Microscopia de luz

Muitos tipos de microscópios se enquadram na categoria de microscópios de luz, que usam luz para visualizar imagens. Exemplos de microscópios de luz incluem microscópios de campo claro, microscópios de campo escuro, microscópios de contraste de fase, microscópios de contraste de interferência diferencial, microscópios de fluorescência, microscópios confocais de varredura a laser e microscópios de dois fótons. Esses vários tipos de microscópios de luz podem ser usados para se complementarem em diagnósticos e pesquisas.

Microscópios Brightfield

O microscópio de campo claro, talvez o tipo de microscópio mais usado, é um microscópio composto com duas ou mais lentes que produzem uma imagem escura em um fundo claro. Alguns microscópios de campo claro são monoculares (com uma única ocular), embora a maioria dos microscópios de campo claro mais recentes sejam binoculares (com duas oculares), como o mostrado na Figura$\PageIndex{1}$; em ambos os casos, cada ocular contém uma lente chamada lente ocular. As lentes oculares normalmente ampliam as imagens 10 vezes (10). Na outra extremidade do tubo corporal, há um conjunto de lentes objetivas em um porta-objetivas giratório. A ampliação dessas lentes objetivas normalmente varia de 4a 100, com a ampliação de cada lente designada na caixa metálica da lente. As lentes ocular e objetiva funcionam juntas para criar uma imagem ampliada. A ampliação total é o produto da ampliação ocular vezes a ampliação objetiva:

\[\text{ocular magnification} \times \text{objective magnification} \nonumber\]

Por exemplo, se uma lente$40 \times$ objetiva for selecionada e a lente ocular for$10\times$, a ampliação total seria

\[(40×)(10×)=400× \nonumber\]

Uma foto de um microscópio é mostrada. A base contém uma fonte de luz (o iluminador, #7) e um botão para ajustar a intensidade da luz (reostato). Fixado em uma extremidade da base está um braço com um palco (#9) para segurar a amostra projetando-se até a metade do braço. O centro do palco tem uma abertura para permitir a passagem da luz do iluminador. Abaixo dessa abertura estão o diafragma e o condensador (#8). Acima dessa abertura estão quatro lentes (lentes objetivas, #3) em uma peça nasal giratória (#2) que contém as várias objetivas. Acima das lentes objetivas estão duas oculares (#1) chamadas lentes oculares. Fixados na parte inferior do palco estão dois botões para mover o slide (botões mecânicos de estágio x-y). No braço abaixo do palco, há 2 botões para focar a imagem. O botão maior (#4) é o foco grosso e o botão menor (#5) é o foco fino. — Figura$\PageIndex{1}$: Componentes de um microscópio de campo claro típico.

Componentes de um microscópio de campo claro típico.

O item que está sendo visualizado é chamado de amostra. A amostra é colocada em uma lâmina de vidro, que é então cortada no palco (uma plataforma) do microscópio. Depois que a lâmina é fixada, a amostra na lâmina é posicionada sobre a luz usando os botões mecânicos de estágio x-y. Esses botões movem o slide na superfície do palco, mas não elevam nem abaixam o palco. Quando a amostra estiver centralizada sobre a luz, a posição do palco pode ser aumentada ou abaixada para focar a imagem. O botão de foco grosso é usado para movimentos em grande escala com lentes objetivas de 4e 10; o botão de foco fino é usado para movimentos de pequena escala, especialmente com lentes objetivas de 40ou 100.

Quando as imagens são ampliadas, elas ficam mais escuras porque há menos luz por unidade de área da imagem. Imagens altamente ampliadas produzidas por microscópios, portanto, requerem iluminação intensa. Em um microscópio de campo claro, essa luz é fornecida por um iluminador, que normalmente é uma lâmpada de alta intensidade abaixo do palco. A luz do iluminador passa pela lente do condensador (localizada abaixo do palco), que focaliza todos os raios de luz na amostra para maximizar a iluminação. A posição do condensador pode ser otimizada usando o botão de foco do condensador conectado; uma vez estabelecida a distância ideal, o condensador não deve ser movido para ajustar o brilho. Se forem necessários níveis de luz abaixo do máximo, a quantidade de luz que atinge a amostra pode ser facilmente ajustada abrindo ou fechando um diafragma entre o condensador e a amostra. Em alguns casos, o brilho também pode ser ajustado usando o reostato, um interruptor dimmer que controla a intensidade do iluminador.

Um microscópio de campo claro cria uma imagem direcionando a luz do iluminador para a amostra; essa luz é transmitida, absorvida, refletida ou refratada diferencialmente por estruturas diferentes. Cores diferentes podem se comportar de forma diferente à medida que interagem com cromóforos (pigmentos que absorvem e refletem determinados comprimentos de onda de luz) em partes da amostra. Freqüentemente, os cromóforos são adicionados artificialmente à amostra por meio de manchas, que servem para aumentar o contraste e a resolução. Em geral, as estruturas na amostra parecerão mais escuras, em várias extensões, do que o fundo brilhante, criando imagens com a máxima nitidez em ampliações de até cerca de 1000. Uma ampliação adicional criaria uma imagem maior, mas sem maior resolução. Isso nos permite ver objetos tão pequenos quanto bactérias, que são visíveis a cerca de 400ou mais, mas não objetos menores, como vírus.

Em ampliações muito altas, a resolução pode ser comprometida quando a luz passa pela pequena quantidade de ar entre a amostra e a lente. Isso se deve à grande diferença entre os índices de refração do ar e do vidro; o ar dispersa os raios de luz antes que eles possam ser focados pela lente. Para resolver esse problema, uma gota de óleo pode ser usada para preencher o espaço entre a amostra e uma lente de imersão em óleo, uma lente especial projetada para ser usada com óleos de imersão. Como o óleo tem um índice de refração muito semelhante ao do vidro, ele aumenta o ângulo máximo no qual a luz que sai da amostra pode atingir a lente. Isso aumenta a luz coletada e, portanto, a resolução da imagem (Figura$\PageIndex{2}$). Uma variedade de óleos pode ser usada para diferentes tipos de luz.

A fotografia a mostra um close-up de uma lente de um microscópio de campo claro. A lente está quase tocando o slide abaixo dela e há óleo cobrindo o espaço entre a lente e o slide. Diagrama b da luz viajando da fonte de luz através da lâmina do microscópio. Sem óleo, a luz refrata ao passar pelo vidro. Muitos desses feixes de luz refratados não atendem às lentes do microscópio. Com o óleo de imersão, os feixes de luz viajam da lâmina, através do óleo de imersão, até a lente do microscópio com mínima refração. — Figura$\PageIndex{2}$: (a) Lentes de imersão em óleo como esta são usadas para melhorar a resolução. (b) Como o óleo de imersão e o vidro têm índices de refração muito semelhantes, há uma quantidade mínima de refração antes que a luz alcance a lente. Sem óleo de imersão, a luz se dispersa ao passar pelo ar acima do slide, degradando a resolução da imagem.

Manutenção do microscópio: melhores práticas

Mesmo um microscópio muito poderoso não pode fornecer imagens de alta resolução se não for limpo e mantido adequadamente. Como as lentes são cuidadosamente projetadas e fabricadas para refratar a luz com um alto grau de precisão, até mesmo uma lente levemente suja ou arranhada refratará a luz de forma não intencional, degradando a imagem da amostra. Além disso, os microscópios são instrumentos bastante delicados e é preciso tomar muito cuidado para evitar danificar peças e superfícies. Entre outras coisas, o cuidado adequado de um microscópio inclui o seguinte:

limpar as lentes com papel para lentes
não permitir que as lentes entrem em contato com o slide (por exemplo, mudando rapidamente o foco)
protegendo a lâmpada (se houver) da quebra
não empurrar uma objetiva em um slide
não usar o botão de focagem grossa ao usar lentes objetivas de 40ou superiores
usando apenas óleo de imersão com uma objetiva de óleo especializada, geralmente a objetiva de 100
limpar o óleo das lentes de imersão após usar o microscópio
limpar qualquer óleo transferido acidentalmente de outras lentes
cobrindo o microscópio ou colocando-o em um gabinete quando não estiver em uso

Microscopia de campo escuro

Um microscópio de campo escuro é um microscópio de campo claro que tem uma modificação pequena, mas significativa, no condensador. Um disco pequeno e opaco (cerca de 1 cm de diâmetro) é colocado entre o iluminador e a lente do condensador. Esse batente de luz opaco, como o disco é chamado, bloqueia a maior parte da luz do iluminador quando ele passa pelo condensador a caminho da lente objetiva, produzindo um cone oco de luz focado na amostra. A única luz que atinge o objetivo é a luz que foi refratada ou refletida pelas estruturas na amostra. A imagem resultante normalmente mostra objetos brilhantes em um fundo escuro (Figura$\PageIndex{3}$)

Um diagrama mostrando o caminho da luz em um microscópio de campo escuro. A luz viaja da fonte de luz para uma parada de luz opaca que bloqueia o centro do feixe de luz. Os feixes externos são focados por uma lente condensadora na amostra na lâmina. A amostra dispersa parte da luz. Outra lente objetiva bloqueia a iluminação direta, mas transmite luz dispersa. — Figura$\PageIndex{3}$: Um batente de luz opaco inserido em um microscópio de campo claro é usado para produzir uma imagem de campo escuro. O interruptor de luz bloqueia a luz que viaja diretamente do iluminador para a lente objetiva, permitindo que somente a luz refletida ou refratada da amostra alcance o olho.

Um batente de luz opaco inserido em um microscópio de campo claro é usado para produzir uma imagem de campo escuro. O interruptor de luz bloqueia a luz que viaja diretamente do iluminador para a lente objetiva, permitindo que somente a luz refletida ou refratada da amostra alcance o olho.

A microscopia de campo escuro geralmente pode criar imagens de alto contraste e alta resolução de amostras sem o uso de manchas, o que é particularmente útil para visualizar amostras vivas que podem ser mortas ou comprometidas pelas manchas. Por exemplo, espiroquetas finas como o Treponema pallidum, o agente causador da sífilis, podem ser melhor visualizadas usando um microscópio de campo escuro (Figura$\PageIndex{4}$).

Uma micrografia mostra um fundo preto com algumas pequenas espirais brancas. — Figura$\PageIndex{4}$: O uso de um microscópio de campo escuro nos permite visualizar amostras vivas e não manchadas da espiroqueta *Treponema pallidum*. Semelhante a um negativo fotográfico, as espiroquetas parecem brilhantes contra um fundo escuro. (crédito: Centros de Controle e Prevenção de Doenças)

O uso de um microscópio de campo escuro nos permite visualizar amostras vivas e não manchadas da espiroqueta Treponema pallidum. Semelhante a um negativo fotográfico, as espiroquetas parecem brilhantes contra um fundo escuro. (crédito: Centros de Controle e Prevenção de Doenças/C.W. Hubbard)

Exercício$\PageIndex{1}$

Identifique as principais diferenças entre a microscopia de campo claro e a microscopia de campo escuro.

Foco clínico: Parte 2

Infecções de feridas como a de Cindy podem ser causadas por muitos tipos diferentes de bactérias, algumas das quais podem se espalhar rapidamente com complicações graves. Identificar a causa específica é muito importante para selecionar um medicamento que possa matar ou impedir o crescimento da bactéria.

Depois de ligar para um médico local sobre o caso de Cindy, a enfermeira do campo envia a amostra da ferida para o laboratório médico mais próximo. Infelizmente, como o acampamento fica em uma área remota, o laboratório mais próximo é pequeno e mal equipado. Um laboratório mais moderno provavelmente usaria outros métodos para cultivar, cultivar e identificar a bactéria, mas, nesse caso, o técnico decide fazer uma montagem úmida a partir da amostra e visualizá-la sob um microscópio de campo claro. Em um suporte úmido, uma pequena gota de água é adicionada à lâmina e uma tampa é colocada sobre a amostra para mantê-la no lugar antes de ser posicionada sob a lente objetiva.

Sob o microscópio de campo claro, o técnico mal consegue ver as células bacterianas porque elas são quase transparentes contra o fundo claro. Para aumentar o contraste, o técnico insere um limite de luz opaco acima do iluminador. A imagem resultante do campo escuro mostra claramente que as células bacterianas são esféricas e agrupadas em cachos, como uvas.

Por que é importante identificar a forma e os padrões de crescimento das células em uma amostra?
Quais outros tipos de microscopia poderiam ser usados de forma eficaz para visualizar essa amostra?

Microscópios de contraste de fase

Os microscópios de contraste de fase usam refração e interferência causadas por estruturas em uma amostra para criar imagens de alto contraste e alta resolução sem manchas. É o tipo de microscópio mais antigo e simples que cria uma imagem alterando os comprimentos de onda dos raios de luz que passam pela amostra. Para criar caminhos de comprimento de onda alterados, um batente anular é usado no condensador. O batente anular produz um cone oco de luz que é focado na amostra antes de atingir a lente objetiva. A objetiva contém uma placa de fase contendo um anel de fase. Como resultado, a luz que viaja diretamente do iluminador passa pelo anel de fase enquanto a luz refratada ou refletida pela amostra passa pela placa. Isso faz com que as ondas que viajam pelo anel fiquem cerca de metade do comprimento de onda fora de fase com aquelas que passam pela placa. Como as ondas têm picos e baixos, elas podem se somar (se estiverem em fase conjunta) ou se cancelar (se estiverem fora de fase). Quando os comprimentos de onda estão fora de fase, os limites das ondas cancelam os picos das ondas, o que é chamado de interferência destrutiva. Estruturas que refratam a luz então aparecem escuras contra um fundo claro de apenas luz não refratada. De forma mais geral, estruturas que diferem em características como índice de refração serão diferentes nos níveis de escuridão (Figura$\PageIndex{5}$).

Um diagrama mostra o caminho da luz através de um microscópio de contraste de fase. A luz da fonte de luz viaja para o anel anular no condensador, que produz um cone de luz focado na amostra. A amostra refrata ou reflete a luz. A luz que viaja diretamente da lente do condensador (luz não difratada) e a luz que viaja pela amostra (luz difratada) estão fora de fase quando passam pela objetiva e pelas placas de fase. Os comprimentos de onda em fase ou fora de fase se somam ou se cancelam. — Figura$\PageIndex{5}$: Este diagrama de um microscópio de contraste de fase ilustra as diferenças de fase entre a luz que passa pelo objeto e o fundo. Essas diferenças são produzidas pela passagem dos raios por diferentes partes de uma placa de fase. Os raios de luz são sobrepostos no plano da imagem, produzindo contraste devido à sua interferência.

Este diagrama de um microscópio de contraste de fase ilustra as diferenças de fase entre a luz que passa pelo objeto e o fundo. Essas diferenças são produzidas pela passagem dos raios por diferentes partes de uma placa de fase. Os raios de luz são sobrepostos no plano da imagem, produzindo contraste devido à sua interferência.

Como aumenta o contraste sem exigir manchas, a microscopia de contraste de fase é frequentemente usada para observar amostras vivas. Certas estruturas, como organelas em células eucarióticas e endosporos em células procarióticas, são especialmente bem visualizadas com microscopia de contraste de fase (Figura$\PageIndex{6}$).

Duas micrografias de uma célula em um fundo escuro são mostradas. Na imagem de campo claro, a célula é um círculo tênue com um pequeno círculo cinza no centro. Na imagem de contraste de fase, a célula é um círculo brilhante com um círculo brilhante no centro. — Figura$\PageIndex{6}$: Esta figura compara uma imagem de campo claro (à esquerda) com uma imagem de contraste de fase (à direita) das mesmas células epiteliais escamosas simples não coradas. As células estão no centro e no canto inferior direito de cada fotografia (o item irregular acima das células são detritos acelulares). Observe que as células não manchadas na imagem de campo claro são quase invisíveis contra o fundo, enquanto as células na imagem de contraste de fase parecem brilhar contra o fundo, revelando muito mais detalhes.

Esta figura compara uma imagem de campo claro (à esquerda) com uma imagem de contraste de fase (à direita) das mesmas células epiteliais escamosas simples não manchadas. As células estão no centro e no canto inferior direito de cada fotografia (o item irregular acima das células são detritos acelulares). Observe que as células não manchadas na imagem de campo claro são quase invisíveis contra o fundo, enquanto as células na imagem de contraste de fase parecem brilhar contra o fundo, revelando muito mais detalhes. (crédito: “Claramente kefir” /Wikimedia Commons)

Microscópios de contraste de interferência diferencial

Os microscópios de contraste de interferência diferencial (DIC) (também conhecidos como óptica Nomarski) são semelhantes aos microscópios de contraste de fase, pois usam padrões de interferência para melhorar o contraste entre as diferentes características de uma amostra. Em um microscópio DIC, dois feixes de luz são criados nos quais a direção do movimento das ondas (polarização) é diferente. Uma vez que os feixes passam pelo espécime ou pelo espaço livre da amostra, eles são recombinados e os efeitos dos espécimes causam diferenças nos padrões de interferência gerados pela combinação dos feixes. Isso resulta em imagens de alto contraste de organismos vivos com aparência tridimensional. Esses microscópios são especialmente úteis para distinguir estruturas em amostras vivas e não coradas. (Figura$\PageIndex{7}$).

Uma micrografia mostra uma cadeia de retângulos com bordas grossas. As cadeias se ramificam e têm grupos de esferas nas extremidades. A imagem inteira tem variações de cinza, mas a diferença de profundidade entre as células na frente e atrás uma da outra é perceptível. — Figura$\PageIndex{7}$: Uma imagem DIC de *Fonsecaea pedrosoi* cultivada em ágar de Leonian modificado. Esse fungo causa cromoblastomicose, uma infecção crônica da pele comum em climas tropicais e subtropicais.

Uma imagem DIC de Fonsecaea pedrosoi cultivada em ágar de Leonian modificado. Esse fungo causa cromoblastomicose, uma infecção crônica da pele comum em climas tropicais e subtropicais.

Exercício$\PageIndex{2}$

Quais são algumas das vantagens do contraste de fase e da microscopia DIC?

Microscópios de fluorescência

Um microscópio de fluorescência usa cromóforos fluorescentes chamados fluorocromos, que são capazes de absorver energia de uma fonte de luz e depois emitir essa energia como luz visível. Os fluorocromos incluem substâncias naturalmente fluorescentes (como clorofilas), bem como manchas fluorescentes que são adicionadas à amostra para criar contraste. Corantes como vermelho do Texas e FITC são exemplos de fluorocromos. Outros exemplos incluem os corantes de ácido nucléico 4',6'-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e laranja de acridina.

O microscópio transmite uma luz de excitação, geralmente uma forma de EMR com um comprimento de onda curto, como luz ultravioleta ou azul, em direção à amostra; os cromóforos absorvem a luz de excitação e emitem luz visível com comprimentos de onda maiores. A luz de excitação é então filtrada (em parte porque a luz ultravioleta é prejudicial aos olhos) para que apenas a luz visível passe pela lente ocular. Isso produz uma imagem da amostra em cores brilhantes contra um fundo escuro.

Os microscópios de fluorescência são especialmente úteis em microbiologia clínica. Eles podem ser usados para identificar patógenos, encontrar espécies específicas em um ambiente ou encontrar a localização de moléculas e estruturas específicas dentro de uma célula. Também foram desenvolvidas abordagens para distinguir células vivas de células mortas usando microscopia de fluorescência com base no fato de elas absorverem fluorocromos específicos. Às vezes, vários fluorocromos são usados na mesma amostra para mostrar estruturas ou características diferentes.

Uma das aplicações mais importantes da microscopia de fluorescência é uma técnica chamada imunofluorescência, que é usada para identificar certos micróbios causadores de doenças, observando se os anticorpos se ligam a eles. (Anticorpos são moléculas de proteína produzidas pelo sistema imunológico que se ligam a patógenos específicos para matá-los ou inibi-los.) Existem duas abordagens para essa técnica: ensaio de imunofluorescência direta (DFA) e ensaio de imunofluorescência indireta (IFA). No DFA, anticorpos específicos (por exemplo, aqueles que têm como alvo o vírus da raiva) são corados com um fluorocromo. Se a amostra contiver o patógeno alvo, pode-se observar a ligação dos anticorpos ao patógeno sob o microscópio fluorescente. Isso é chamado de coloração primária de anticorpos porque os anticorpos corados se ligam diretamente ao patógeno.

No IFA, os anticorpos secundários são corados com um fluorocromo em vez de anticorpos primários. Os anticorpos secundários não se ligam diretamente ao patógeno, mas se ligam aos anticorpos primários. Quando os anticorpos primários não corados se ligam ao patógeno, os anticorpos secundários fluorescentes podem ser observados se ligando aos anticorpos primários. Assim, os anticorpos secundários são ligados indiretamente ao patógeno. Como vários anticorpos secundários geralmente podem se ligar a um anticorpo primário, o IFA aumenta o número de anticorpos fluorescentes ligados à amostra, facilitando a visualização das características da amostra (Figura$\PageIndex{8}$).

A micrografia a mostra esferas verdes fluorescentes em um fundo preto. A micrografia b mostra formas de vermes fluorescentes em um fundo preto. O diagrama c mostra o processo de imunofluorescência direta. Na imunofluorescência direta, um fluorocromo é ligado a um anticorpo primário e o anticorpo primário está ligado ao antígeno. Na imunofluorescência indireta, o fluorocromo é ligado a um anticorpo secundário. O anticorpo secundário está ligado ao anticorpo primário; e o anticorpo primário está ligado ao antígeno. — Figura$\PageIndex{8}$: (a) Uma coloração imunofluorescente direta é usada para visualizar a *Neisseria gonorrhoeae*, a bactéria que causa a gonorreia. (b) Uma coloração imunofluorescente indireta é usada para visualizar larvas de *Schistosoma mansoni*, um verme parasita que causa a esquistossomose, uma doença intestinal comum nos trópicos. (c) Na imunofluorescência direta, a mancha é absorvida por um anticorpo primário, que se liga ao antígeno. Na imunofluorescência indireta, a mancha é absorvida por um anticorpo secundário, que se liga a um anticorpo primário, que, por sua vez, se liga ao antígeno. (crédito a: modificação do trabalho dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças; crédito b: modificação do trabalho pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças)

Exercício$\PageIndex{3}$

Por que os fluorocromos devem ser usados para examinar uma amostra sob um microscópio de fluorescência?

Microscópios confocais

Enquanto outras formas de microscopia de luz criam uma imagem focada ao máximo a uma única distância do observador (a profundidade, ou plano z), um microscópio confocal usa um laser para escanear vários planos z sucessivamente. Isso produz inúmeras imagens bidimensionais de alta resolução em várias profundidades, que podem ser incorporadas em uma imagem tridimensional por um computador. Assim como nos microscópios de fluorescência, as manchas fluorescentes geralmente são usadas para aumentar o contraste e a resolução. A clareza da imagem é aprimorada ainda mais por uma abertura estreita que elimina qualquer luz que não seja do plano z. Os microscópios confocais são, portanto, muito úteis para examinar amostras espessas, como biofilmes, que podem ser examinados vivos e não fixos (Figura$\PageIndex{9}$).

Uma micrografia mostrando esferas (células) roxas agrupadas em feixes cinza-escuros (glicanos a granel). — Figura$\PageIndex{9}$: A microscopia confocal pode ser usada para visualizar estruturas como esse biofilme de cianobactéria que habita o telhado. (crédito: modificação do trabalho da Sociedade Americana de Microbiologia).

Microscópios de dois fótons

Embora os microscópios fluorescentes e confocais originais tenham permitido uma melhor visualização de características únicas nas amostras, ainda havia problemas que impediam a visualização ideal. A sensibilidade efetiva da microscopia de fluorescência ao visualizar amostras espessas era geralmente limitada pelo reflexo fora de foco, o que resultou em baixa resolução. Essa limitação foi bastante reduzida no microscópio confocal por meio do uso de um orifício confocal para rejeitar a fluorescência de fundo fora de foco com seções ópticas finas (<1 μm) e não borradas. No entanto, até mesmo os microscópios confocais não tinham a resolução necessária para visualizar amostras de tecidos espessos. Esses problemas foram resolvidos com o desenvolvimento do microscópio de dois fótons, que usa uma técnica de varredura, fluorocromos e luz de longo comprimento de onda (como infravermelho) para visualizar amostras. A baixa energia associada à luz de longo comprimento de onda significa que dois fótons devem atingir um local ao mesmo tempo para excitar o fluorocromo. A baixa energia da luz de excitação é menos prejudicial às células, e o longo comprimento de onda da luz de excitação penetra mais facilmente em amostras espessas. Isso torna o microscópio de dois fótons útil para examinar células vivas em tecidos intactos — fatias cerebrais, embriões, órgãos inteiros e até animais inteiros.

Atualmente, o uso de microscópios de dois fótons é limitado a laboratórios clínicos e de pesquisa avançados devido aos altos custos dos instrumentos. Um único microscópio de dois fótons normalmente custa entre $300.000 e $500.000, e os lasers usados para excitar os corantes usados nas amostras também são muito caros. No entanto, à medida que a tecnologia melhora, os microscópios de dois fótons podem se tornar mais facilmente disponíveis em ambientes clínicos.

Exercício$\PageIndex{4}$

Quais tipos de amostras são melhor examinadas usando microscopia confocal ou de dois fótons?

Microscopia eletrônica

A resolução teórica máxima das imagens criadas por microscópios de luz é, em última análise, limitada pelos comprimentos de onda da luz visível. A maioria dos microscópios de luz só pode ampliar 1000, e alguns podem ampliar até 1500, mas isso não começa a se aproximar do poder de ampliação de um microscópio eletrônico (EM), que usa feixes de elétrons de comprimento de onda curto em vez de luz para aumentar a ampliação e a resolução.

Os elétrons, como a radiação eletromagnética, podem se comportar como ondas, mas com comprimentos de onda de 0,005 nm, eles podem produzir uma resolução muito melhor do que a luz visível. Um EM pode produzir uma imagem nítida que é ampliada em até 100.000. Assim, os EMs podem resolver estruturas subcelulares, bem como algumas estruturas moleculares (por exemplo, fitas únicas de DNA); no entanto, a microscopia eletrônica não pode ser usada em material vivo devido aos métodos necessários para preparar as amostras.

Existem dois tipos básicos de EM: o microscópio eletrônico de transmissão (TEM) e o microscópio eletrônico de varredura (SEM) (Figura$\PageIndex{10}$). O TEM é um pouco análogo ao microscópio de luz de campo claro em termos de funcionamento. No entanto, ele usa um feixe de elétrons vindo de cima da amostra que é focado usando uma lente magnética (em vez de uma lente de vidro) e projetado através da amostra em um detector. Os elétrons passam pela amostra e, em seguida, o detector captura a imagem (Figura$\PageIndex{11}$).

A fotografia A mostra um microscópio eletrônico de transmissão: uma máquina em forma de tubo grande conectada a uma mesa ao lado de um computador. A fotografia b mostra um microscópio eletrônico de varredura: uma máquina com muitas projeções sentada em uma mesa ao lado de um computador. — Figura$\PageIndex{10}$: (a) Um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). (b) Um microscópio eletrônico de varredura (SEM). (crédito a: modificação do trabalho de “Deshi” /Wikimedia Commons; crédito b: modificação do trabalho pela “ZEISS Microscopy” /Flickr)

Diagramas comparando TEM e microscópios de luz são mostrados. No microscópio de luz, a luz da fonte de luz é focada pelo condensador na amostra. A luz é então ainda mais focada pela lente objetiva e pela lente ocular e, finalmente, chega ao espectador. Em um TEM, um canhão de elétrons libera elétrons por meio de um tubo. Esses elétrons são focados na amostra por eletroímãs na borda do tubo. O feixe de elétrons então alcança a lente objetiva e, finalmente, o espectador. — Figura$\PageIndex{11}$: Os microscópios eletrônicos usam ímãs para focar feixes de elétrons da mesma forma que os microscópios de luz usam lentes para focar a luz.

Para que os elétrons passem pela amostra em um TEM, a amostra deve ser extremamente fina (20—100 nm de espessura). A imagem é produzida devido à opacidade variável em várias partes da amostra. Essa opacidade pode ser aumentada manchando a amostra com materiais como metais pesados, que são densos em elétrons. O TEM exige que a viga e a amostra estejam no vácuo e que a amostra seja muito fina e desidratada. As etapas específicas necessárias para preparar uma amostra para observação sob um EM são discutidas em detalhes na próxima seção.

Os SEMs formam imagens de superfícies de amostras, geralmente de elétrons que são eliminados de amostras por um feixe de elétrons. Isso pode criar imagens altamente detalhadas com uma aparência tridimensional que são exibidas em um monitor (Figura$\PageIndex{12}$). Normalmente, as amostras são secas e preparadas com fixadores que reduzem artefatos, como o enrugamento, que podem ser produzidos por secagem, antes de serem revestidos com uma fina camada de metal, como ouro. Enquanto a microscopia eletrônica de transmissão requer seções muito finas e permite ver estruturas internas, como organelas e o interior das membranas, a microscopia eletrônica de varredura pode ser usada para visualizar as superfícies de objetos maiores (como um grão de pólen), bem como as superfícies de amostras muito pequenas ( Figura$\PageIndex{13}$). Alguns EMs podem ampliar uma imagem em até 2.000.000. ¹

O diagrama TEM mostra um fio de alta tensão conectado a um canhão de elétrons que libera um feixe de elétrons. O feixe de elétrons passa pela primeira lente do condensador (conectada a uma abertura do condensador), depois pela segunda lente do condensador (também conectada a uma abertura do condensador) e, em seguida, pela amostra no suporte da amostra e na trava de ar (que também é conectada a uma lente objetiva e abertura). Finalmente, o feixe de elétrons viaja para a tela fluorescente e a câmera. O SEM começa com um canhão de elétrons que dispara feixes de elétrons através de um ânodo, através de uma lente de condensador, através de bobinas de varredura e sobre a amostra no palco. Um detector de elétrons retroespalhados detecta elétrons que viajam diretamente de volta da amostra; detectores secundários de elétrons detectam elétrons que viajam para os lados. — Figura$\PageIndex{12}$: Essas ilustrações esquemáticas comparam os componentes dos microscópios eletrônicos de transmissão e dos microscópios eletrônicos de varredura.

A Figura a mostra uma micrografia TEM com um fundo claro e uma célula escura no centro. Uma linha dupla delineia a borda da célula e as teias de material dentro da célula são visíveis. A Figura b mostra uma micrografia SEM que tem grandes aglomerados roxos em um fundo verde com pequenos orifícios. A tridimensionalidade dos aglomerados roxos é aparente. — Figura$\PageIndex{13}$: (a) Esta imagem TEM de células em um biofilme mostra estruturas internas bem definidas das células devido aos diferentes níveis de opacidade na amostra. (b) Esta imagem SEM colorida da bactéria *Staphylococcus aureus* ilustra a capacidade da microscopia eletrônica de varredura de renderizar imagens tridimensionais da estrutura superficial das células. (crédito a: modificação do trabalho da Sociedade Americana de Microbiologia; crédito b: modificação do trabalho pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças)

Exercício$\PageIndex{5}$

Quais são algumas vantagens e desvantagens da microscopia eletrônica, em oposição à microscopia de luz, para examinar amostras microbiológicas?
Quais tipos de amostras são melhor examinadas usando TEM? PARECE?

Usando microscopia para estudar biofilmes

Um biofilme é uma comunidade complexa de uma ou mais espécies de microrganismos, normalmente se formando como um revestimento viscoso preso a uma superfície devido à produção de uma substância extrapolimérica (EPS) que se fixa a uma superfície ou na interface entre superfícies (por exemplo, entre ar e água). Na natureza, os biofilmes são abundantes e frequentemente ocupam nichos complexos dentro dos ecossistemas (Figura$\PageIndex{14}$). Na medicina, os biofilmes podem revestir dispositivos médicos e existir dentro do corpo. Por possuírem características únicas, como maior resistência ao sistema imunológico e aos antimicrobianos, os biofilmes são de particular interesse tanto para microbiologistas quanto para médicos.

Como os biofilmes são espessos, eles não podem ser observados muito bem usando microscopia de luz; fatiar um biofilme para criar uma amostra mais fina pode matar ou perturbar a comunidade microbiana. A microscopia confocal fornece imagens mais claras de biofilmes porque pode focar em um plano z por vez e produzir uma imagem tridimensional de uma amostra espessa. Corantes fluorescentes podem ser úteis na identificação de células dentro da matriz. Além disso, técnicas como imunofluorescência e hibridização in situ de fluorescência (FISH), nas quais sondas fluorescentes são usadas para se ligar ao DNA, podem ser usadas.

A microscopia eletrônica pode ser usada para observar biofilmes, mas somente após a desidratação da amostra, que produz artefatos indesejáveis e distorce a amostra. Além dessas abordagens, é possível acompanhar as correntes de água através das formas (como cones e cogumelos) dos biofilmes, usando vídeo do movimento de esferas com revestimento fluorescente (Figura$\PageIndex{15}$).

Os estágios de um biofilme são mostrados. No estágio 1 (fixação inicial), algumas células flageladas se fixam em uma superfície. No estágio 2 (fixação irreversível), aglomerados de células são encontrados na superfície. No estágio 3 (maturação), os aglomerados aumentaram. No estágio 4 (maturação 2), os aglomerados se fundiram e aumentaram muito. No estágio 5 (dispersão), o grande aglomerado libera células flageladas para longe da superfície. Esses estágios também são mostrados em micrografias: 1) pontos pequenos, 2) aglomerados maiores, 3) aglomerados maiores, 4) uma massa grande, 5) uma massa grande com uma abertura na parte superior. — Figura$\PageIndex{14}$: Um biofilme se forma quando bactérias planctônicas (flutuantes) de uma ou mais espécies aderem a uma superfície, produzem lodo e formam uma colônia. (crédito: Public Library of Science).

Uma micrografia com fundo preto contendo muitos retângulos brilhantes em aglomerados é mostrada. — Figura$\PageIndex{15}$: Nesta imagem, várias espécies de bactérias crescem em um biofilme em aço inoxidável (corado com DAPI para miscroscopia de epifluorescência). (crédito: Ricardo Murga, Rodney Donlan).

Microscopia por sonda de digitalização

Um microscópio com sonda de varredura não usa luz ou elétrons, mas sim sondas muito nítidas que passam pela superfície da amostra e interagem diretamente com ela. Isso produz informações que podem ser reunidas em imagens com ampliações de até 100.000.000. Essas grandes ampliações podem ser usadas para observar átomos individuais em superfícies. Até o momento, essas técnicas têm sido usadas principalmente para pesquisas e não para diagnósticos.

Existem dois tipos de microscópio com sonda de varredura: o microscópio de tunelamento de varredura (STM) e o microscópio de força atômica (AFM). Um STM usa uma sonda que passa logo acima da amostra, pois uma polarização de tensão constante cria o potencial de uma corrente elétrica entre a sonda e a amostra. Essa corrente ocorre por meio do tunelamento quântico de elétrons entre a sonda e a amostra, e a intensidade da corrente depende da distância entre a sonda e a amostra. A sonda é movida horizontalmente acima da superfície e a intensidade da corrente é medida. A microscopia de tunelamento de varredura pode mapear efetivamente a estrutura das superfícies em uma resolução na qual átomos individuais podem ser detectados.

Semelhante a um STM, os AFMs têm uma sonda fina que passa logo acima da amostra. No entanto, em vez de medir variações na corrente a uma altura constante acima da amostra, um AFM estabelece uma corrente constante e mede as variações na altura da ponta da sonda à medida que ela passa sobre a amostra. Quando a ponta da sonda passa sobre a amostra, as forças entre os átomos (forças de van der Waals, forças capilares, ligações químicas, forças eletrostáticas e outras) fazem com que ela se mova para cima e para baixo. A deflexão da ponta da sonda é determinada e medida usando a lei da elasticidade de Hooke, e essas informações são usadas para construir imagens da superfície da amostra com resolução no nível atômico (Figura$\PageIndex{16}$).

A micrografia a mostra um círculo organizado em linhas repetidas. A micrografia b mostra longos fios em uma pilha. — Figura$\PageIndex{16}$: STMs e AFMs nos permitem visualizar imagens no nível atômico. (a) Esta imagem STM de uma superfície de ouro puro mostra átomos individuais de ouro dispostos em colunas. (b) Esta imagem AFM mostra moléculas longas de nanocelulose em forma de fita, uma substância criada em laboratório derivada de fibras vegetais. (crédito a: modificação do trabalho de “Erwinrossen” /Wikimedia Commons).

Exercício$\PageIndex{6}$

Qual tem maior ampliação, um microscópio de luz ou um microscópio de sonda de varredura?
Cite uma vantagem e uma limitação da microscopia de varredura por sonda.

Uma tabela de tipos de microscópios de luz. Eles usam luz visível ou ultravioleta para produzir uma imagem. Ampliação: até cerca de 1000x. Os microscópios de campo claro são comumente usados em uma ampla variedade de aplicações de laboratório como microscópio padrão e produzem uma imagem em um fundo claro. A imagem de amostra de Bacillus sp. mostra bastonetes vermelhos em um fundo claro; pequenos pontos verdes nas células vermelhas indicam endosporos. Os microscópios de campo escuro aumentam o contraste sem manchas ao produzir uma imagem brilhante em um fundo escuro. Eles são especialmente úteis para visualizar espécimes vivos. A imagem de amostra (Borrelia burgdorferi) mostra espirais brilhantes em um fundo escuro. Os microscópios de contraste de fase usam refração e interferência causadas por estruturas na amostra para criar imagens de alto contraste e alta resolução sem manchas, o que os torna úteis para a visualização de amostras vivas e estruturas, como endosporos e organelas. A imagem de amostra (Pseudomonas sp.) mostra bastonetes escuros com uma auréola brilhante. O contraste de interferência diferencial (DIC) usa padrões de interferência para melhorar o contraste entre diferentes características de uma amostra para produzir imagens de alto contraste de organismos vivos com aparência tridimensional, tornando-o especialmente útil na distinção de estruturas dentro de amostras vivas e não manchadas. As imagens visualizadas revelam estruturas detalhadas dentro das células. A imagem da amostra (Escherichia coli 0157:H7) mostra pequenos ovais tridimensionais. A fluorescência usa manchas fluorescentes para produzir uma imagem. Microscópios fluorescentes podem ser usados para identificar patógenos, encontrar espécies específicas, distinguir os vivos dos mortos ou encontrar a localização de moléculas específicas dentro de uma célula; também usados para imunofluorescência. A imagem de amostra (Pseuodomonas putida corada com corantes fluorescentes para visualizar a cápsula) mostra uma haste verde em um fundo preto. Os microscópios confocais usam um laser para escanear vários planos z sucessivamente, produzindo inúmeras imagens bidimensionais de alta resolução em várias profundidades que podem ser incorporadas em uma imagem tridimensional por um computador, o que o torna útil para examinar amostras espessas, como biofilmes. A imagem de amostra (células do intestino de camundongo coradas com corante fluorescente) mostra células de várias cores em um fundo escuro. — Figura$\PageIndex{17}$: (crédito “Brightfield”: modificação do trabalho pela Sociedade Americana de Microbiologia; crédito “Darkfield”: modificação do trabalho pela Sociedade Americana de Microbiologia; crédito “Contraste de fase”: modificação do trabalho pela Sociedade Americana de Microbiologia; crédito “DIC”: modificação do trabalho pela American Society for Microbiology Society for Microbiology; crédito “Fluorescence”: modificação do trabalho da American Society for Microbiology; crédito “Confocal”: modificação do trabalho pela American Society for Microbiology; crédito “Two-photon”: modificação do trabalho de Alberto Diaspro, Paolo Bianchini, Giuseppe Vicidomini, Mario Faretta, Paola Ramoino , César Usai).

Tabela de microscópios eletrônicos que usam feixes de elétrons focados com ímãs para produzir uma imagem. Ampliação: 20—100.000 x ou mais. Os microscópios eletrônicos de transmissão (TEM) usam meios eletrônicos que passam por uma amostra para visualizar imagens pequenas; úteis para observar amostras pequenas e finas, como seções de tecido e estruturas subcelulares. A imagem de amostra (vírus Ebola) mostra um tubo em forma de letra d em uma extremidade. Os microscópios eletrônicos de varredura (SEM) usam feixes de elétrons para visualizar superfícies; útil para observar os detalhes tridimensionais da superfície das amostras. A imagem de amostra (Campylobactor jejuni) mostra espessas espirais tridimensionais. — Figura$\PageIndex{18}$: (crédito “TEM”: modificação do trabalho da Sociedade Americana de Microbiologia; crédito “SEM”: modificação do trabalho pela Sociedade Americana de Microbiologia)

Figura$\PageIndex{19}$: Técnicas de microscopia para microscópios de sonda de varredura

Conceitos principais e resumo

Vários tipos de microscópios usam várias tecnologias para gerar micrografias. A maioria é útil para um tipo específico de amostra ou aplicação.
A microscopia óptica usa lentes para focalizar a luz em uma amostra para produzir uma imagem. Os microscópios de luz comumente usados incluem microscópios de campo claro, campo escuro, contraste de fase, contraste de interferência diferencial, fluorescência, confocais e microscópios de dois fótons.
A microscopia eletrônica concentra elétrons na amostra usando ímãs, produzindo uma ampliação muito maior do que a microscopia de luz. O microscópio eletrônico de transmissão (TEM) e o microscópio eletrônico de varredura (SEM) são duas formas comuns.
A microscopia com sonda de varredura produz imagens de ampliação ainda maior ao medir o feedback de sondas nítidas que interagem com a amostra. Os microscópios de sonda incluem o microscópio de varredura de tunelamento (STM) e o microscópio de força atômica (AFM).

Notas de pé

1 “Microscópio Eletrônico de Transmissão JEM-ARM200F”, JEOL USA Inc, www.jeolusa.com/products/TRAN... especificações. Acessado em 28/8/2015.

Glossário

microscópio de força atômica: um microscópio de sonda de varredura que usa uma sonda fina que passa logo acima da amostra para medir as forças entre os átomos e a sonda

binocular: com duas oculares

microscópio de campo claro: um microscópio de luz composto com duas lentes; produz uma imagem escura em um fundo claro

botão de focagem grosseiro: um botão em um microscópio que produz movimentos relativamente grandes para ajustar o foco

cromóforos: pigmentos que absorvem e refletem determinados comprimentos de onda de luz (dando-lhes uma cor)

lente condensadora: uma lente em um microscópio que focaliza a luz da fonte de luz para a amostra

microscópio confocal: um microscópio a laser de varredura que usa corantes fluorescentes e lasers de excitação para criar imagens tridimensionais
microscópio de campo escuro: um microscópio de luz composto que produz uma imagem brilhante em um fundo escuro; normalmente um microscópio de campo claro modificado

diafragma: um componente de um microscópio; normalmente consiste em um disco sob o palco com orifícios de vários tamanhos; pode ser ajustado para permitir que mais ou menos luz da fonte de luz alcance a amostra

microscópio diferencial de interferência e contraste: um microscópio que usa luz polarizada para aumentar o contraste

microscópio eletrônico: um tipo de microscópio que usa feixes de elétrons de comprimento de onda curto em vez de luz para aumentar a ampliação e a resolução

botão de focagem fina: um botão em um microscópio que produz movimentos relativamente pequenos para ajustar o foco

microscópio de fluorescência: um microscópio que usa fluorocromos naturais ou manchas fluorescentes para aumentar o contraste

fluorocromos: cromóforos que fluorescem (absorvem e depois emitem luz)

iluminador: a fonte de luz em um microscópio

imunofluorescência: uma técnica que usa um microscópio de fluorescência e fluorocromos específicos de anticorpos para determinar a presença de patógenos específicos em uma amostra

monocular: ter uma única ocular

lentes objetivas: em um microscópio de luz, as lentes mais próximas da amostra, normalmente localizadas nas extremidades das torres

lente ocular: em um microscópio, a lente mais próxima do olho (também chamada de ocular)
lente de imersão em óleo: uma lente objetiva especial em um microscópio projetada para ser usada com óleo de imersão para melhorar a resolução
microscópio de contraste de fase: um microscópio de luz que usa um batente anular e uma placa anular para aumentar o contraste
reostato: um interruptor dimmer que controla a intensidade do iluminador em um microscópio de luz
microscópio eletrônico de varredura (SEM): um tipo de microscópio eletrônico que reflete elétrons da amostra, formando uma imagem da superfície
microscópio de varredura: um microscópio que usa uma sonda que viaja pela superfície de uma amostra a uma distância constante enquanto a corrente, que é sensível ao tamanho da lacuna, é medida
microscópio de tunelamento de digitalização: um microscópio que usa uma sonda que passa logo acima da amostra como um viés de tensão constante cria o potencial de uma corrente elétrica entre a sonda e a amostra
estágio: a plataforma de um microscópio na qual as lâminas são colocadas
ampliação total: em um microscópio de luz é um valor calculado multiplicando a ampliação do ocular pela ampliação das lentes objetivas
microscópio eletrônico de transmissão (TEM): um tipo de microscópio eletrônico que usa um feixe de elétrons, focado com ímãs, que passa por uma amostra fina
microscópio de dois fótons: um microscópio que usa luz infravermelha ou de comprimento de onda longo para fluorescer fluorocromos na amostra
botões mecânicos de estágio x-y: botões em um microscópio que são usados para ajustar a posição da amostra na superfície do palco, geralmente para centralizá-la diretamente acima da luz