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2.1: As propriedades da luz

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    Objetivos de

    • Identificar e definir as características da radiação eletromagnética (EMR) usada na microscopia
    • Explique como as lentes são usadas na microscopia para manipular a luz visível e ultravioleta (UV)

    Foco clínico: Parte I

    Cindy, uma conselheira de 17 anos em um acampamento esportivo de verão, arranhou o joelho jogando basquete há duas semanas. Na época, ela achava que era apenas uma pequena abrasão que cicatrizaria, como muitas outras antes. Em vez disso, a ferida começou a parecer uma picada de inseto e continua a ficar cada vez mais dolorida e inchada.

    A enfermeira do campo examina a lesão e observa uma grande quantidade de pus escorrendo da superfície. Preocupada com o fato de Cindy ter desenvolvido uma infecção potencialmente agressiva, ela esfrega a ferida para coletar uma amostra do local da infecção. Em seguida, ela limpa o pus e cuida da ferida, instruindo Cindy a manter a área limpa e a voltar no dia seguinte. Quando Cindy sai, a enfermeira envia a amostra para o laboratório médico mais próximo para ser analisada ao microscópio.

    Exercício\(\PageIndex{1}\)

    Quais são algumas coisas que podemos aprender sobre essas bactérias observando-as ao microscópio?

    A luz visível consiste em ondas eletromagnéticas que se comportam como outras ondas. Portanto, muitas das propriedades da luz que são relevantes para a microscopia podem ser entendidas em termos do comportamento da luz como uma onda. Uma propriedade importante das ondas de luz é o comprimento de onda, ou a distância entre um pico de uma onda e o próximo pico. A altura de cada pico (ou profundidade de cada vale) é chamada de amplitude. Em contraste, a frequência da onda é a taxa de vibração da onda ou o número de comprimentos de onda dentro de um período de tempo especificado (Figura\(\PageIndex{1}\)).

    A Figura a mostra uma linha ondulada com ondas que se repetem uniformemente para cima e para baixo. Uma linha reta no centro da linha ondulada indica a base das ondas. A distância do pico de uma onda para outra é o comprimento de onda. A distância da linha de base até o pico de uma onda ou a distância da linha de base até o vale de uma onda é chamada de amplitude. A Figura b mostra três ondas com a unidade de tempo rotulada na parte inferior. A linha superior tem ondas que estão amplamente espalhadas. Ondas com um comprimento de onda amplo têm uma frequência baixa. A linha de fundo tem ondas que estão próximas umas das outras. Ondas com comprimento de onda estreito têm alta frequência. A linha média tem um comprimento de onda médio e, portanto, uma frequência média.
    Figura\(\PageIndex{1}\): (a) A amplitude é a altura de uma onda, enquanto o comprimento de onda é a distância entre um pico e o próximo. (b) Essas ondas têm diferentes frequências ou taxas de vibração. A onda no topo tem a menor frequência, pois tem o menor número de picos por unidade de tempo. A onda na parte inferior tem a maior frequência.

    Interações da luz

    As ondas de luz interagem com os materiais ao serem refletidas, absorvidas ou transmitidas. A reflexão ocorre quando uma onda salta de um material. Por exemplo, um pedaço de pano vermelho pode refletir luz vermelha em nossos olhos enquanto absorve outras cores de luz. A absorbância ocorre quando um material captura a energia de uma onda de luz. No caso de plásticos que brilham no escuro, a energia da luz pode ser absorvida e posteriormente reemitida como outra forma de fosforescência. A transmissão ocorre quando uma onda viaja através de um material, como a luz através do vidro (o processo de transmissão é chamado de transmitância). Quando um material permite que uma grande proporção de luz seja transmitida, ele pode fazer isso porque é mais fino ou mais transparente (com mais transparência e menos opacidade). A figura\(\PageIndex{2}\) ilustra a diferença entre transparência e opacidade.

    A figura a mostra as pontas das mãos enluvadas de uma pessoa segurando um prato transparente com tampa. A placa contém um material avermelhado na parte inferior da placa. A figura b mostra um pedaço de metal nas mãos de uma pessoa. O material é escuro com algumas regiões brilhantes.
    Figura\(\PageIndex{2}\): (a) Uma placa de Petri é feita de plástico ou vidro transparente, o que permite a transmissão de uma alta proporção de luz. Essa transparência nos permite ver pelas laterais do prato para ver o conteúdo. (b) Essa fatia de um meteorito de ferro é opaca (ou seja, tem opacidade). A luz não é transmitida pelo material, impossibilitando a visualização da parte da mão coberta pelo objeto. (crédito a: modificação da obra de Umberto Salvagnin; crédito b: modificação da obra por “Waifer X” /Flickr)

    As ondas de luz também podem interagir umas com as outras por interferência, criando padrões complexos de movimento. Jogar duas pedras em uma poça faz com que as ondas na superfície da poça interajam, criando padrões de interferência complexos. As ondas de luz podem interagir da mesma forma.

    Além de interferir umas nas outras, as ondas de luz também podem interagir com pequenos objetos ou aberturas por meio de curvatura ou dispersão. Isso é chamado de difração. A difração é maior quando o objeto é menor em relação ao comprimento de onda da luz (a distância entre dois picos consecutivos de uma onda de luz). Freqüentemente, quando as ondas se difratam em diferentes direções em torno de um obstáculo ou abertura, elas interferem umas nas outras.

    Exercício\(\PageIndex{2}\)

    1. Se uma onda de luz tem um comprimento de onda longo, é provável que ela tenha uma frequência baixa ou alta?
    2. Se um objeto é transparente, ele reflete, absorve ou transmite luz?

    Lentes e refração

    No contexto da microscopia, a refração é talvez o comportamento mais importante exibido pelas ondas de luz. A refração ocorre quando as ondas de luz mudam de direção à medida que entram em um novo meio (Figura\(\PageIndex{3}\)). Diferentes materiais transparentes transmitem luz em velocidades diferentes; assim, a luz pode mudar de velocidade ao passar de um material para outro. Essa mudança na velocidade geralmente também causa uma mudança na direção (refração), com o grau de mudança dependente do ângulo da luz recebida.

    A imagem a mostra um feixe de luz apontado para um pedaço de vidro. Quando o feixe de luz atinge o material de vidro transparente, ele se curva em aproximadamente 45°. Esse raio de luz curvo é o raio refratado. O material opaco sobre o qual o vidro está assentado não tem nenhuma luz brilhando através dele. O diagrama b mostra uma seta chamada raio incidente apontando em um ângulo de 45° para baixo em direção a uma região sombreada. No ponto em que o raio incidente atinge a região sombreada, duas outras flechas começam. Uma dessas setas aponta para um ângulo de 90° do raio incidente (e para longe da região sombreada) e é o raio refletido. A segunda flecha continua pela região sombreada, mas em um ângulo ligeiramente curvado em relação ao raio incidente. Essa segunda flecha é o raio refletido.
    Figura\(\PageIndex{3}\): (a) A refração ocorre quando a luz passa de um meio, como ar, para outro, como vidro, mudando a direção dos raios de luz. (b) Conforme mostrado neste diagrama, os raios de luz que passam de um meio para outro podem ser refratados ou refletidos. (crédito a: modificação do trabalho de “ajizai” /Wikimedia Commons).

    A medida em que um material diminui a velocidade de transmissão em relação ao espaço vazio é chamada de índice de refração desse material. Grandes diferenças entre os índices de refração de dois materiais resultarão em uma grande quantidade de refração quando a luz passar de um material para o outro. Por exemplo, a luz se move muito mais lentamente pela água do que pelo ar, então a luz que entra na água pelo ar pode mudar muito de direção. Dizemos que a água tem um índice de refração maior do que o ar (Figura\(\PageIndex{4}\)).

    Uma foto mostra um poste sendo colocado na água. Parece que o poste se curva quando atinge a água.
    Figura\(\PageIndex{4}\): Este poste reto parece se curvar em um ângulo ao entrar na água. Essa ilusão de ótica se deve à grande diferença entre os índices de refração do ar e da água.

    Quando a luz cruza um limite em um material com um índice de refração mais alto, sua direção se torna mais próxima da perpendicular ao limite (ou seja, mais em direção a um normal a esse limite; Figura\(\PageIndex{5}\)). Esse é o princípio por trás das lentes. Podemos pensar em uma lente como um objeto com um limite curvo (ou uma coleção de prismas) que coleta toda a luz que a atinge e a refrata para que tudo se encontre em um único ponto chamado ponto da imagem (foco). Uma lente convexa pode ser usada para ampliar porque ela pode focar a uma distância mais próxima do que o olho humano, produzindo uma imagem maior. Lentes côncavas e espelhos também podem ser usados em microscópios para redirecionar o caminho da luz. A figura\(\PageIndex{5}\) mostra o ponto focal (o ponto de imagem quando a luz que entra na lente é paralela) e a distância focal (a distância até o ponto focal) para lentes convexas e côncavas.

    O diagrama a (prisma) mostra uma pirâmide clara com luz entrando em uma superfície. A luz que sai da outra superfície é curvada e é a luz refratada. Uma linha pontilhada indica o caminho que o feixe de luz original teria percorrido se não estivesse dobrado. A região acima da linha pontilhada é rotulada como alto índice de refração; a região abaixo da linha é rotulada como baixo índice de refração. O diagrama b (lente convexa) mostra uma lente com uma protuberância no centro. A luz entra em cada lado da cúpula e é focada em um ponto além da lente e alinhada com o centro da cúpula. O ponto em que a luz se concentra é o ponto focal; a distância do ponto focal até o centro da lente é a distância focal. O diagrama c (lente côncava) mostra uma lente que se curva para dentro de cada lado. A luz que entra nessa lente é dobrada para fora, longe do centro da curva da lente. Uma linha pontilhada mostra o caminho linear para trás para cada um dos feixes de luz curvados. O ponto em que todas as linhas pontilhadas se encontram (que está do outro lado da lente) é o ponto focal.
    Figura\(\PageIndex{5}\): (a) Uma lente é como uma coleção de prismas, como a mostrada aqui. (b) Quando a luz passa por uma lente convexa, ela é refratada em direção a um ponto focal no outro lado da lente. A distância focal é a distância até o ponto focal. (c) A luz que passa por uma lente côncava é refratada de um ponto focal na frente da lente.

    O olho humano contém uma lente que nos permite ver imagens. Essa lente focaliza a luz refletida pelos objetos na frente do olho na superfície da retina, que é como uma tela na parte de trás do olho. As lentes artificiais colocadas na frente do olho (lentes de contato, óculos ou lentes microscópicas) focalizam a luz antes que ela seja focada (novamente) pela lente do olho, manipulando a imagem que acaba na retina (por exemplo, fazendo-a parecer maior).

    As imagens geralmente são manipuladas controlando as distâncias entre o objeto, a lente e a tela, bem como a curvatura da lente. Por exemplo, para uma determinada quantidade de curvatura, quando um objeto está mais próximo da lente, os pontos focais estão mais distantes da lente. Como resultado, muitas vezes é necessário manipular essas distâncias para criar uma imagem focada em uma tela. Da mesma forma, mais curvatura cria pontos de imagem mais próximos da lente e uma imagem maior quando a imagem está em foco. Essa propriedade é frequentemente descrita em termos de distância focal ou distância até o ponto focal.

    Exercício\(\PageIndex{3}\)

    1. Explique como uma lente focaliza a luz no ponto da imagem.
    2. Cite alguns fatores que afetam a distância focal de uma lente.

    Espectro eletromagnético e cor

    A luz visível é apenas uma forma de radiação eletromagnética (EMR), um tipo de energia que está ao nosso redor. Outras formas de EMR incluem microondas, raios-X e ondas de rádio, entre outras. Os diferentes tipos de EMR se enquadram no espectro eletromagnético, que é definido em termos de comprimento de onda e frequência. O espectro da luz visível ocupa uma faixa relativamente pequena de frequências entre a luz infravermelha e a luz ultravioleta (Figura\(\PageIndex{6}\)).

    Uma série de escalas indica que a imagem mostra o menor comprimento de onda (10 sobrescrito -18 m) à esquerda e o maior comprimento de onda (10 sobrescrito 6 m) à direita. As frequências variam de mais de 10 24 Hz sobrescritos à esquerda a 1 Hz à direita. As energias variam de 10 sobrescritos 12 ev à esquerda a 10 sobrescritos -12 à direita. Os tipos de radiação listados acima dessas escalas (da esquerda para a direita) são: radiação cósmica, raios gama, raios X, radiação ultravioleta, visível, infravermelha, radiação Terahertz, radar, transmissão de televisão e rádio e circuitos de corrente alternada. A parte de luz visível do espectro é retirada e mostra luz azul a 400 nm, luz verde a 500 nm, luz amarela a 600 nm e luz vermelha a 700 nm.
    Figura\(\PageIndex{6}\): O espectro eletromagnético varia de raios gama de alta frequência a ondas de rádio de baixa frequência. A luz visível é a faixa relativamente pequena de frequências eletromagnéticas que podem ser detectadas pelo olho humano. No espectro eletromagnético, a luz visível fica entre a luz ultravioleta e a infravermelha. (crédito: modificação da obra de Johannes Ahlmann).

    Enquanto o comprimento de onda representa a distância entre os picos adjacentes de uma onda de luz, a frequência, em uma definição simplificada, representa a taxa de oscilação. Ondas com frequências mais altas têm comprimentos de onda mais curtos e, portanto, têm mais oscilações por unidade de tempo do que ondas de frequência mais baixa. As ondas de frequência mais alta também contêm mais energia do que as ondas de frequência mais baixa. Essa energia é fornecida como partículas elementares chamadas fótons. Ondas de frequência mais alta fornecem mais fótons energéticos do que ondas de baixa frequência.

    Fótons com energias diferentes interagem de forma diferente com a retina. No espectro da luz visível, cada cor corresponde a uma frequência e comprimento de onda específicos (Figura\(\PageIndex{6}\)). A menor frequência da luz visível aparece como a cor vermelha, enquanto a mais alta aparece como a cor violeta. Quando a retina recebe luz visível de muitas frequências diferentes, percebemos isso como luz branca. No entanto, a luz branca pode ser separada em suas cores componentes usando refração. Se passarmos a luz branca por um prisma, cores diferentes serão refratadas em direções diferentes, criando um espectro semelhante ao arco-íris em uma tela atrás do prisma. Essa separação de cores é chamada de dispersão e ocorre porque, para um determinado material, o índice de refração é diferente para diferentes frequências de luz.

    Certos materiais podem refratar formas não visíveis de EMR e, de fato, transformá-las em luz visível. Certos corantes fluorescentes, por exemplo, absorvem luz ultravioleta ou azul e depois usam a energia para emitir fótons de uma cor diferente, emitindo luz em vez de simplesmente vibrarem. Isso ocorre porque a absorção de energia faz com que os elétrons saltem para estados de energia mais altos, após o qual eles quase imediatamente caem de volta para seus estados fundamentais, emitindo quantidades específicas de energia como fótons. Nem toda a energia é emitida em um determinado fóton, então os fótons emitidos serão de menor energia e, portanto, de menor frequência do que os absorvidos. Assim, um corante como o vermelho do Texas pode ser excitado pela luz azul, mas emite luz vermelha; ou um corante como o isotiocianato de fluoresceína (FITC) pode absorver (invisível) luz ultravioleta de alta energia e emitir luz verde (Figura\(\PageIndex{7}\)). Em alguns materiais, os fótons podem ser emitidos após um atraso após a absorção; nesse caso, o processo é chamado de fosforescência. O plástico que brilha no escuro funciona usando material fosforescente.

    Uma imagem mostra uma célula grande em primeiro plano e outras células mais em segundo plano. Cada célula tem uma forma irregular com um grande círculo azul no centro. As linhas verdes cercam o círculo azul e se estendem em direção às bordas da célula. O resto da célula é vermelho com uma borda vermelha brilhante. O fundo da imagem é preto.
    Figura\(\PageIndex{7}\): Os corantes fluorescentes absorvidos por essas células endoteliais da artéria pulmonar bovina emitem cores brilhantes quando excitados pela luz ultravioleta sob um microscópio de fluorescência. Várias estruturas celulares absorvem diferentes corantes. Os núcleos são corados de azul com 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI); os microtúbulos são marcados em verde por um anticorpo ligado ao FITC; e os filamentos de actina são marcados em vermelho com faloidina ligada à tetrametilrodamina (TRITC).

    Exercício\(\PageIndex{4}\)

    1. Qual tem uma frequência mais alta: luz vermelha ou luz verde?
    2. Explique por que a dispersão ocorre quando a luz branca passa por um prisma.
    3. Por que os corantes fluorescentes emitem uma cor de luz diferente da que absorvem?

    Ampliação, resolução e contraste

    Os microscópios ampliam as imagens e usam as propriedades da luz para criar imagens úteis de objetos pequenos. A ampliação é definida como a capacidade de uma lente ampliar a imagem de um objeto em comparação com o objeto real. Por exemplo, uma ampliação de 10significa que a imagem aparece 10 vezes o tamanho do objeto vista a olho nu.

    Uma maior ampliação geralmente melhora nossa capacidade de ver detalhes de objetos pequenos, mas a ampliação por si só não é suficiente para criar as imagens mais úteis. Geralmente, é útil melhorar a resolução dos objetos: a capacidade de saber se dois pontos ou objetos separados estão separados. Uma imagem de baixa resolução parece confusa, enquanto uma imagem de alta resolução parece nítida. Dois fatores afetam a resolução. O primeiro é o comprimento de onda. Comprimentos de onda mais curtos são capazes de resolver objetos menores; portanto, um microscópio eletrônico tem uma resolução muito maior do que um microscópio de luz, pois usa um feixe de elétrons com um comprimento de onda muito curto, em oposição à luz visível de longo comprimento de onda usada por um microscópio de luz. O segundo fator que afeta a resolução é a abertura numérica, que é uma medida da capacidade da lente de captar luz. Quanto maior a abertura numérica, melhor a resolução.

    Mesmo quando um microscópio tem alta resolução, pode ser difícil distinguir estruturas pequenas em muitas amostras porque os microrganismos são relativamente transparentes. Muitas vezes, é necessário aumentar o contraste para detectar estruturas diferentes em uma amostra. Vários tipos de microscópios usam diferentes características de luz ou elétrons para aumentar o contraste e as diferenças visíveis entre as partes de uma amostra (consulte Instrumentos de Microscopia). Além disso, corantes que se ligam a algumas estruturas, mas não a outras, podem ser usados para melhorar o contraste entre imagens de objetos relativamente transparentes (consulte Coloração de amostras microscópicas).

    Exercício\(\PageIndex{5}\)

    1. Explique a diferença entre ampliação e resolução.
    2. Explique a diferença entre resolução e contraste.
    3. Cite dois fatores que afetam a resolução.

    Conceitos principais e resumo

    • As ondas de luz que interagem com os materiais podem ser refletidas, absorvidas ou transmitidas, dependendo das propriedades do material.
    • As ondas de luz podem interagir umas com as outras (interferência) ou ser distorcidas por interações com pequenos objetos ou aberturas (difração).
    • A refração ocorre quando as ondas de luz mudam de velocidade e direção à medida que passam de um meio para outro. Diferenças nos índices de refração de dois materiais determinam a magnitude das mudanças direcionais quando a luz passa de um para o outro.
    • Uma lente é um meio com uma superfície curva que refrata e focaliza a luz para produzir uma imagem.
    • A luz visível faz parte do espectro eletromagnético; ondas de luz de diferentes frequências e comprimentos de onda são diferenciadas como cores pelo olho humano.
    • Um prisma pode separar as cores da luz branca (dispersão) porque diferentes frequências de luz têm índices de refração diferentes para um determinado material.
    • Corantes fluorescentes e materiais fosforescentes podem efetivamente transformar a radiação eletromagnética não visível em luz visível.
    • O poder de um microscópio pode ser descrito em termos de ampliação e resolução.
    • A resolução pode ser aumentada encurtando o comprimento de onda, aumentando a abertura numérica da lente ou usando manchas que melhoram o contraste.

    Glossário

    absorvância
    quando uma molécula captura energia de um fóton e vibra ou se estende, usando a energia
    amplitude
    a altura de uma onda
    contrastam
    diferenças visíveis entre partes de uma amostra microscópica
    difração
    a mudança de direção (flexão ou expansão) que ocorre quando uma onda de luz interage com uma abertura ou barreira
    dispersão
    a separação da luz de diferentes frequências devido a diferentes graus de refração
    fluorescentes
    a capacidade de certos materiais de absorver energia e, em seguida, liberar imediatamente essa energia na forma de luz
    distância focal
    a distância da lente até o ponto da imagem quando o objeto está a uma distância definida da lente (essa também é a distância até o ponto focal)
    ponto focal
    uma propriedade da lente; o ponto da imagem quando a luz que entra na lente é paralelo (ou seja, o objeto está a uma distância infinita da lente)
    frequência
    a taxa de vibração de uma onda de luz ou outra onda eletromagnética
    ponto de imagem (foco)
    uma propriedade da lente e a distância do objeto até a lente; o ponto em que uma imagem está em foco (o ponto da imagem geralmente é chamado de foco)
    interferência
    distorção de uma onda de luz devido à interação com outra onda
    ampliação
    o poder de um microscópio (ou lente) de produzir uma imagem que parece maior do que a amostra real, expressa como um fator do tamanho real
    abertura numérica
    uma medida da capacidade de uma lente de captar luz
    opacidade
    a propriedade de absorver ou bloquear a luz
    fosforescência
    a capacidade de certos materiais de absorver energia e depois liberar essa energia como luz após um atraso
    reflexão
    quando a luz volta de uma superfície
    refração
    flexão das ondas de luz, que ocorre quando uma onda de luz passa de um meio para outro
    índice de refração
    uma medida da magnitude da desaceleração das ondas de luz por um meio específico
    resolução
    a capacidade de distinguir entre dois pontos em uma imagem
    transmitância
    a quantidade de luz que passa por um meio
    transparência
    a propriedade de permitir a passagem da luz
    Comprimento de onda
    a distância entre um pico de uma onda e o próximo pico