Skip to main content
Global

17.5B: טכניקות בסיסיות בניתוח חלבונים

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    209636

    • Boundless
    • Boundless
    \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    מטרות למידה
    • תאר את הטכניקות המשמשות בפרוטאומיקה לניתוח חלבונים

    טכניקות בסיסיות בניתוח חלבונים

    המטרה הסופית של פרוטאומיקה היא לזהות או להשוות את החלבונים המתבטאים בגנום נתון בתנאים ספציפיים, לחקור את האינטראקציות בין החלבונים ולהשתמש במידע כדי לחזות התנהגות תאים או לפתח מטרות תרופתיות. בדיוק כפי שהגנום מנותח באמצעות הטכניקה הבסיסית של רצף DNA, פרוטאומיקה דורשת טכניקות לניתוח חלבונים. הטכניקה הבסיסית לניתוח חלבונים, המקבילה לרצף DNA, היא ספקטרומטריית מסה.

    דמות
    איור\(\PageIndex{1}\): ספקטרומטר מסה: יינון לייזר בעזרת מטריצה - ספקטרומטר מסה זמן טיסה (MALDI-TOF). ניתן להשתמש בספקטרומטריית מסה בניתוח חלבונים.

    ספקטרומטריית מסה

    ספקטרומטריית מסה משמשת לזיהוי וקביעת המאפיינים של מולקולה. זוהי טכניקה שבה מולקולות שלב הגז מיוננות ויחס המסה למטען שלהן נמדד על ידי התבוננות בהבדלי תאוצה של יונים בעת הפעלת שדה חשמלי. יונים קלים יותר יאיצו מהר יותר ויתגלו תחילה. אם המסה נמדדת בדיוק, ניתן לזהות את הרכב המולקולה. במקרה של חלבונים, ניתן לזהות את הרצף. האתגר של טכניקות המשמשות לניתוחים פרוטאומיים הוא הקושי באיתור כמויות קטנות של חלבונים, אך ההתקדמות בספקטרומטריה אפשרה לחוקרים לנתח דגימות קטנות מאוד של חלבון. עם זאת, שינויים בביטוי החלבון במצבים חולים יכולים להיות קשים להבחנה. חלבונים הם מולקולות לא יציבות באופן טבעי, מה שהופך את הניתוח הפרוטאומי לקשה הרבה יותר מניתוח גנומי.

    קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ותהודה מגנטית גרעינית

    קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן מאפשרת למדענים לקבוע את המבנה התלת מימדי של גביש חלבון ברזולוציה אטומית. קריסטלוגרפים מכוונים צילומי רנטגן בעלי עוצמה גבוהה לעבר גביש זעיר המכיל טריליוני מולקולות זהות. הגביש מפזר את צילומי הרנטגן לגלאי אלקטרוני מאותו סוג המשמש לצילום תמונות במצלמה דיגיטלית. לאחר כל פיצוץ של צילומי רנטגן, שנמשך בין מספר שניות למספר שעות, החוקרים מסובבים במדויק את הגביש על ידי הזנת הכיוון הרצוי שלו למחשב השולט במנגנון הרנטגן. זה מאפשר למדענים ללכוד בתלת מימד כיצד הגביש מפזר, או מפזר, צילומי רנטגן. העוצמה של כל קרן מפוזרת מוזנת למחשב, המשתמש במשוואה מתמטית כדי לחשב את המיקום של כל אטום במולקולה המגובשת. התוצאה היא תמונה דיגיטלית תלת מימדית של המולקולה.

    דמות
    איור\(\PageIndex{1}\): קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן: צילומי רנטגן שפוגעים בגרעיני אטום מפוזרים על גבי גלאי.

    טכניקת הדמיית חלבון נוספת, תהודה מגנטית גרעינית (NMR), משתמשת בתכונות המגנטיות של אטומים כדי לקבוע את המבנה התלת מימדי של חלבונים. ספקטרוסקופיית NMR ייחודית ביכולת לחשוף את המבנה האטומי של מקרומולקולות בתמיסה, בתנאי שניתן להשיג תמיסה מרוכזת מאוד. טכניקה זו תלויה בעובדה שגרעינים אטומיים מסוימים הם מגנטיים במהותם. השינוי הכימי של הגרעינים תלוי בסביבתם המקומית. הספינים של גרעינים שכנים מתקשרים זה עם זה בדרכים המספקות מידע מבני סופי שניתן להשתמש בו לקביעת מבנים תלת מימדיים שלמים של חלבונים.

    מיקרו-מערכי חלבון והקרנה דו-היברידית

    מיקרו מערכי חלבון שימשו גם לחקר אינטראקציות בין חלבונים. אלה עיבודים בקנה מידה גדול של המסך הדו-היברידי הבסיסי. הנחת היסוד מאחורי המסך הדו-היברידי היא שלרוב גורמי השעתוק האוקריוטיים יש תחומי הפעלה ומחייבים מודולריים שעדיין יכולים להפעיל שעתוק גם כאשר הם מפוצלים לשני שברים נפרדים, כל עוד השברים מובאים בסמיכות זה לזה. באופן כללי, גורם השעתוק מחולק לתחום מחייב DNA (BD) ולתחום הפעלה (AD). חלבון אחד מעניין מתמזג גנטית ל- BD וחלבון אחר מתמזג ל- AD. אם שני החלבונים המעניינים נקשרים זה לזה, אז גם ה-BD וה-AD יתאחדו ויפעילו גן מדווח שמאותת אינטראקציה של שני החלבונים ההיברידיים.

    דמות
    איור\(\PageIndex{1}\): הקרנה דו-היברידית: נעשה שימוש בהקרנה דו-היברידית כדי לקבוע אם שני חלבונים מקיימים אינטראקציה. בשיטה זו, גורם שעתוק מחולק לתחום מחייב DNA (BD) ותחום הפעלה (AD). תחום הקישור מסוגל לקשור את האמרגן בהיעדר תחום המפעיל, אך הוא אינו מפעיל שעתוק. חלבון הנקרא פיתיון מחובר ל- BD, וחלבון הנקרא טרף מחובר ל- AD. שעתוק מתרחש רק אם הטרף "תופס" את הפיתיון.

    כתם מערבי

    הכתם המערבי, או חלבון אימונובלוט, היא טכניקה המשלבת אלקטרופורזה של חלבון ונוגדנים לאיתור חלבונים בדגימה. כתם מערבי מהיר ופשוט למדי בהשוואה לטכניקות לעיל, ולכן יכול לשמש מבחן לאימות תוצאות מניסויים אחרים. דגימת החלבון מופרדת תחילה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל, לאחר מכן מועברת לניטרוצלולוזה או סוג אחר של ממברנה, ולבסוף מוכתמת בנוגדן ראשוני הקושר באופן ספציפי את החלבון המעניין. נוגדן משני פלואורסצנטי או מסומן רדיואקטיבי נקשר לנוגדן הראשוני ומספק אמצעי זיהוי באמצעות צילום או סרט רנטגן, בהתאמה.

    נקודות מפתח

    • ספקטרומטריית מסה היא טכניקה שימושית לקביעת גודל קומפלקס חלבון או חלבון.
    • קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ו-NMR הן טכניקות שימושיות לקביעת המבנה התלת-ממדי של קומפלקס חלבון או חלבון.
    • מיקרו-מערכי חלבון שימושיים לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון.

    מונחי מפתח

    • מיקרו מערך: כל אחד מכמה מכשירים המכילים מערך דו מימדי של כמויות קטנות של חומר ביולוגי המשמש לסוגים שונים של מבחנים
    • גן כתב: גן שחוקרים מצמידים לרצף רגולטורי של גן אחר בעל עניין והמוצר שלו ניתן לזיהוי בקלות במבחנים