Skip to main content
Global

17.3A: אסטרטגיות המשמשות בפרויקטי רצף

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    209661

    • Boundless
    • Boundless
    \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    האסטרטגיות המשמשות לרצף גנומים כוללות את שיטת סנגר, רצף רובה ציד, סוף זוגי ורצף הדור הבא.

    מטרות למידה
    • השווה את האסטרטגיות השונות המשמשות לרצף גנום שלם: שיטת סנגר, רצף רובה ציד, רצף קצה זוגי ורצף הדור הבא

    נקודות מפתח

    • שיטת סנגר היא טכניקת רצף בסיסית המשתמשת בדידאוקסינוקלאוטידים (ddNTPs) המסומנים פלואורסצנטית במהלך שכפול ה- DNA, מה שמביא למספר גדילים קצרים של DNA משוכפל המסתיימים בנקודות שונות, בהתבסס על המקום שבו שולב ה- ddNTP.
    • רצף רובה ציד הוא שיטה החותכת באופן אקראי שברי DNA לחתיכות קטנות יותר ולאחר מכן, בעזרת מחשב, לוקחת את שברי ה-DNA, מנתחת אותם לרצפים חופפים ומרכיבה מחדש את כל רצף ה-DNA.
    • רצף קצה זוגי הוא סוג של רצף רובה ציד המשמש לגנום גדול יותר ומנתח את שני הקצוות של שברי ה-DNA לחפיפה.
    • רצף הדור הבא הוא סוג של רצף שהוא אוטומטי ומסתמך על תוכנה מתוחכמת לרצף DNA מהיר.

    מונחי מפתח

    • פלואורופור: מולקולה או קבוצה פונקציונלית המסוגלת לקרינה
    • קונטיג: קבוצה של מקטעי DNA חופפים, הנגזרים ממקור יחיד של חומר גנטי, שממנו ניתן להסיק את הרצף המלא
    • דידאוקסינוקלאוטיד: כל נוקלאוטיד שנוצר מדאוקסינוקלאוטיד על ידי אובדן קבוצת הידרוקסיל שנייה מקבוצת הדאוקסיריבוז

    אסטרטגיות המשמשות בפרויקטי רצף

    טכניקת הרצף הבסיסית המשמשת בכל פרויקטי הרצף המודרניים היא שיטת סיום השרשרת (הידועה גם כשיטת דידאוקסי), שפותחה על ידי פרד סנגר בשנות השבעים. שיטת סיום השרשרת כוללת שכפול DNA של תבנית חד-גדילית עם שימוש בפריימר ודאוקסינוקלאוטיד רגיל (dNTP), שהוא מונומר, או יחידה אחת, של DNA. הפריימר וה-dNTP מעורבבים עם חלק קטן של דידאוקסינוקלאוטידים המסומנים פלואורסצנטית (ddNTPs). ה-ddNTPs הם מונומרים שחסרים להם קבוצת הידרוקסיל (—OH) באתר שבו נוקלאוטיד אחר מתחבר בדרך כלל ליצירת שרשרת. כל ddNTP מסומן בצבע שונה של פלואורופור. בכל פעם ש-ddNTP משולב בגדיל המשלים הגדל, הוא מסיים את תהליך שכפול ה-DNA, מה שמביא למספר גדילים קצרים של DNA משוכפל שכל אחד מהם מסתיים בנקודה אחרת במהלך השכפול. כאשר תערובת התגובה מעובדת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל לאחר הפרדה לגדילים בודדים, גדילי ה-DNA המרובים, ששוכפלו לאחרונה, יוצרים סולם בשל גודלם השונה. מכיוון ש- ddNTPs מסומנים באופן פלואורסצנטי, כל רצועה בג'ל משקפת את גודל גדיל ה- DNA ואת ה- ddNTP שהפסיק את התגובה. הצבעים השונים של ddNTP המסומנים בפלואורופור עוזרים לזהות את ddNTP המשולב במיקום זה. קריאת הג'ל על בסיס הצבע של כל רצועה בסולם מייצרת את רצף גדיל התבנית.

    דמות
    איור\(\PageIndex{1}\): שיטת סנגר: שיטת סיום שרשרת הדידאוקסי של פרדריק סנגר משתמשת בדידאוקסינוקלאוטידים, שבהם ניתן לסיים את שבר ה-DNA בנקודות שונות. ה- DNA מופרד על בסיס גודל, וניתן לקרוא להקות אלה, בהתבסס על גודל השברים.
    דמות
    איור\(\PageIndex{1}\): מבנה של דידאוקסינוקלאוטיד: דידאוקסינוקלאוטיד דומה במבנהו לדאוקסינוקלאוטיד, אך חסרה לו קבוצת ההידרוקסיל 3 ′ (מסומנת בתיבה). כאשר משולב דידאוקסינוקלאוטיד בגדיל DNA, סינתזת ה- DNA נעצרת.

    אסטרטגיות מוקדמות: רצף רובה ציד ורצף סוף זוגי

    בשיטת רצף הרובה, מספר עותקים של שבר DNA נחתכים באופן אקראי לחתיכות קטנות רבות יותר (קצת כמו מה שקורה למחסנית זריקה עגולה כאשר יורים מרובה ציד). לאחר מכן כל המקטעים עוברים רצף בשיטת רצף השרשרת. לאחר מכן, בעזרת מחשב, השברים מנותחים כדי לראות היכן הרצפים שלהם חופפים. על ידי התאמת רצפים חופפים בסוף כל שבר, ניתן לשנות את כל רצף ה- DNA. רצף גדול יותר המורכב מרצפים קצרים חופפים נקרא contig. כאנלוגיה, קחו בחשבון שלמישהו יש ארבעה עותקים של תצלום נוף שמעולם לא ראיתם קודם לכן ואינו יודע דבר על איך הוא אמור להופיע. לאחר מכן האדם קורע כל תצלום בידיו, כך שיהיו חלקים בגודל שונה מכל עותק. לאחר מכן האדם מערבב את כל החלקים יחד ומבקש ממך לשחזר את התצלום. באחד החלקים הקטנים יותר אתה רואה הר. ביצירה גדולה יותר אתה רואה שאותו הר נמצא מאחורי אגם. שבר שלישי מציג רק את האגם, אך הוא מגלה שיש בקתה על שפת האגם. לכן, מהתבוננות במידע החופף בשלושת השברים הללו, אתה יודע שהתמונה מכילה הר מאחורי אגם שיש בו בקתה על חופו. זהו העיקרון מאחורי שחזור רצפי DNA שלמים באמצעות רצף רובה ציד.

    במקור, רצף רובה ציד ניתח רק קצה אחד של כל שבר עבור חפיפות. זה הספיק לרצף גנומים קטנים. עם זאת, הרצון לרצף גנומים גדולים יותר, כמו זה של אדם, הוביל לפיתוח רצף רובה ציד כפול חבית, הידוע יותר רשמית בשם רצף סוף זוגי. ברצף קצה זוגי, שני הקצוות של כל שבר מנותחים לחפיפה. רצף סוף זוגי הוא, אם כן, מסורבל יותר מרצף רובה ציד, אך קל יותר לשחזר את הרצף מכיוון שיש מידע זמין יותר.

    רצף הדור הבא

    מאז 2005, טכניקות רצף אוטומטיות המשמשות מעבדות נמצאות תחת המטריה של רצף הדור הבא, שהיא קבוצה של טכניקות אוטומטיות המשמשות לרצף DNA מהיר. רצפים אוטומטיים ובעלות נמוכה אלה יכולים ליצור רצפים של מאות אלפי או מיליוני שברים קצרים (25 עד 500 זוגות בסיס) בטווח של יום אחד. תוכנה מתוחכמת משמשת לניהול התהליך המסורבל של סדר בכל השברים.