Skip to main content
Global

17.1B: טכניקות בסיסיות לתמרון חומר גנטי (DNA ו- RNA)

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    209629

    • Boundless
    • Boundless
    \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    טכניקות בסיסיות המשמשות במניפולציה של חומרים גנטיים כוללות מיצוי, אלקטרופורזה של ג'ל, PCR ושיטות סופג.

    מטרות למידה
    • הבחין בין הטכניקות הבסיסיות המשמשות לתמרון DNA ו- RNA

    נקודות מפתח

    • הצעד הראשון ללמוד או לעבוד עם חומצות גרעין כולל בידוד או מיצוי של DNA או RNA מהתאים.
    • אלקטרופורזה של ג'ל תלויה ביונים הטעונים שלילית הקיימים בחומצות גרעין ב- pH ניטרלי או בסיסי להפרדת מולקולות על בסיס גודל.
    • ניתן להגביר אזורים ספציפיים של DNA באמצעות תגובת שרשרת פולימראז לניתוח נוסף.
    • סופג דרומי כרוך בהעברת DNA לקרום ניילון, ואילו סופג צפוני הוא העברת RNA לקרום ניילון; טכניקות אלה מאפשרות לחקור דגימות לנוכחות רצפים מסוימים.

    מונחי מפתח

    • דנטורציה: שינוי מבנה הקיפול של חלבון (ובכך של תכונות פיזיקליות) הנגרם מחימום, שינויים ב-pH או חשיפה לכימיקלים מסוימים
    • אלקטרופורזה: שיטה להפרדה וניתוח של מולקולות גדולות, כגון חלבונים או חומצות גרעין, על ידי נדידת תמיסה קולואידית שלהן דרך ג'ל בהשפעת שדה חשמלי
    • תגובת שרשרת פולימראז: טכניקה בביולוגיה מולקולרית ליצירת עותקים מרובים של DNA מדגימה

    טכניקות בסיסיות לתמרון חומר גנטי (DNA ו- RNA)

    כדי להבין את הטכניקות הבסיסיות המשמשות לעבודה עם חומצות גרעין, זכרו שחומצות גרעין הן מקרומולקולות העשויות מנוקלאוטידים (סוכר, פוספט ובסיס חנקני) המקושרים על ידי קשרי פוספודיסטר. לקבוצות הפוספט במולקולות אלו יש מטען שלילי נטו. קבוצה שלמה של מולקולות DNA בגרעין נקראת הגנום. ל- DNA שני גדילים משלימים המקושרים על ידי קשרי מימן בין הבסיסים המשויכים. ניתן להפריד בין שני הגדילים על ידי חשיפה לטמפרטורות גבוהות (דנטורציה של DNA) וניתן לחדש אותם מחדש על ידי קירור. ניתן לשכפל את ה-DNA על ידי האנזים DNA פולימראז. בניגוד ל- DNA שנמצא בגרעין התאים האוקריוטיים, מולקולות ה- RNA עוזבות את הגרעין. הסוג הנפוץ ביותר של RNA שמנותח הוא ה- RNA שליח (mRNA) מכיוון שהוא מייצג את הגנים המקודדים לחלבון המתבטאים באופן פעיל.

    מיצוי DNA ו- RNA

    כדי ללמוד או לתפעל חומצות גרעין, תחילה יש לבודד או לחלץ את ה- DNA או ה- RNA מהתאים. ניתן לעשות זאת באמצעות טכניקות שונות. רוב טכניקות מיצוי חומצות הגרעין כוללות שלבים לפרוץ את התא ולהשתמש בתגובות אנזימטיות כדי להשמיד את כל המקרומולקולות שאינן רצויות (כגון פירוק מולקולות לא רצויות והפרדה מדגימת ה-DNA). תאים נשברים באמצעות מאגר תמוגה (תמיסה שהיא בעיקר חומר ניקוי); פירוק פירושו "לפצל". אנזימים אלה מפרקים מולקולות שומנים בקרומי התא והגרעין. מקרומולקולות מושבתות באמצעות אנזימים כגון פרוטאזות המפרקות חלבונים וריבונוקלאזות (RNases) המפרקות RNA. לאחר מכן מזורז ה- DNA באמצעות אלכוהול. DNA גנומי אנושי נראה בדרך כלל כמסה לבנה ג'לטינית. ניתן לאחסן דוגמאות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך שנים.

    דמות
    איור\(\PageIndex{1}\): מיצוי DNA: דיאגרמה זו מציגה את השיטה הבסיסית המשמשת להפקת DNA.

    ניתוח RNA מבוצע כדי לחקור דפוסי ביטוי גנים בתאים. RNA באופן טבעי מאוד לא יציב מכיוון ש-RNases נמצאים בדרך כלל בטבע וקשה מאוד להשבית אותם. בדומה ל- DNA, מיצוי RNA כרוך בשימוש במאגרים ואנזימים שונים כדי להשבית מקרומולקולות ולשמר את ה- RNA.

    ג'ל אלקטרופורזה

    מכיוון שחומצות גרעין הן יונים טעונים שלילית ב- pH ניטרלי או בסיסי בסביבה מימית, ניתן לגייס אותן על ידי שדה חשמלי. אלקטרופורזה של ג'ל היא טכניקה המשמשת להפרדת מולקולות על בסיס גודל באמצעות מטען זה ועשויה להיות מופרדת ככרומוזומים שלמים או שברים. חומצות הגרעין נטענות לחריץ ליד האלקטרודה השלילית של מטריצת ג'ל נקבובית ונמשכות לכיוון האלקטרודה החיובית בקצה הנגדי של הג'ל. מולקולות קטנות יותר נעות דרך הנקבוביות בג'ל מהר יותר ממולקולות גדולות יותר; הבדל זה בקצב הנדידה מפריד בין השברים על בסיס גודל. ישנן דגימות סטנדרטיות במשקל מולקולרי שניתן להריץ לצד המולקולות כדי לספק השוואת גודל. ניתן לצפות בחומצות גרעין במטריצת ג'ל באמצעות צבעים פלואורסצנטיים או צבעוניים שונים. שברי חומצת גרעין מובהקים מופיעים כרצועות במרחקים ספציפיים מהחלק העליון של הג'ל (קצה האלקטרודה השלילי) על בסיס גודלם.

    דמות
    איור\(\PageIndex{1}\): ג'ל אלקטרופורזה: מוצגים שברי DNA משבע דגימות המופעלות על ג'ל, מוכתמות בצבע פלואורסצנטי ונראות תחת אור UV.

    הגברה של שברי חומצת גרעין על ידי תגובת שרשרת פולימראז

    תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא טכניקה המשמשת להגברת אזורים ספציפיים של DNA לניתוח נוסף. PCR משמש למטרות רבות במעבדות, כגון שיבוט של שברי גנים לניתוח מחלות גנטיות, זיהוי DNA זר מזהם בדגימה והגברה של DNA לרצף. יישומים מעשיים יותר כוללים קביעת אבהות וגילוי מחלות גנטיות.

    דמות
    איור\(\PageIndex{1}\): הגברה PCR: תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, משמשת להגברת רצף ספציפי של DNA. פריימרים - פיסות DNA קצרות המשלימות לכל קצה של רצף המטרה - משולבים עם DNA גנומי, טאק פולימראז ודאוקסינוקלאוטידים. טאק פולימראז הוא פולימראז DNA המבודד מהחיידק התרמו-יציב Thermus aquaticus המסוגל לעמוד בטמפרטורות הגבוהות המשמשות ב- PCR. Thermus aquaticus גדל באגן הגייזר התחתון של הפארק הלאומי ילוסטון. PCR טרנסקריפטאז הפוך (RT-PCR) דומה ל- PCR, אך cDNA עשוי מתבנית RNA לפני תחילת ה- PCR.

    ניתן להגביר שברי DNA גם מתבנית RNA בתהליך הנקרא PCR טרנסקריפטאז הפוך (RT-PCR). השלב הראשון הוא ליצור מחדש את גדיל תבנית ה-DNA המקורי (הנקרא cDNA) על ידי החלת נוקלאוטידים של DNA על ה-mRNA. תהליך זה נקרא תמלול הפוך. זה דורש נוכחות של אנזים הנקרא טרנסקריפטאז הפוך. לאחר יצירת ה- cDNA, ניתן להשתמש ב- PCR רגיל כדי להגביר אותו.

    הכלאה, סופג דרומי וסופג צפוני

    ניתן לחקור דגימות חומצות גרעין, כגון DNA גנומי מקוטע ותמציות RNA, לנוכחות רצפים מסוימים. שברי DNA קצרים הנקראים בדיקות מתוכננים ומסומנים בצבעים רדיואקטיביים או פלואורסצנטיים כדי לסייע בזיהוי. אלקטרופורזה של ג'ל מפרידה בין שברי חומצת הגרעין לפי גודלם. השברים בג'ל מועברים לאחר מכן על קרום ניילון בהליך הנקרא סופג. לאחר מכן ניתן לחקור את שברי חומצת הגרעין הקשורים לפני השטח של הממברנה באמצעות רצפי בדיקה ספציפיים המסומנים רדיואקטיבית או פלואורסצנטית. כאשר DNA מועבר לקרום ניילון, הטכניקה נקראת Southern blotting; כאשר RNA מועבר לקרום ניילון, זה נקרא סופג צפוני. כתמים דרומיים משמשים לאיתור נוכחות של רצפי DNA מסוימים בגנום נתון, וכתמים צפוניים משמשים לזיהוי ביטוי גנים.

    דמות
    איור\(\PageIndex{1}\): טכניקות סופג: סופג דרומי משמש למציאת רצף מסוים בדגימת DNA. שברי DNA מופרדים על ג'ל, מועברים לקרום ניילון ומודגרים בעזרת בדיקת DNA המשלימה לרצף העניין. סופג צפוני דומה לסופג הדרומי, אך RNA מופעל על הג'ל במקום על ה- DNA. בספיגה מערבית, חלבונים מופעלים על ג'ל ומתגלים באמצעות נוגדנים.